3,282 matches
-
tuburile minuțios și resuspendați peleta în PBS prin sonicare. Stocați antigenul în alicoți la -70ș C. TITRAREA ANTIGENULUI ELISA VBLA Antigenul Elisa la boala limbii albastre se titrează cu testul Elisa indirect. Diluții duble de antigen se titrează față de o diluție constantă (1/50) cu anticorp monoclonal 3-17-A3. Protocolul este următorul: PROCEDURA 1. Diluați antigen VBLA în PBS pe placa de microtitrare într-o serie de diluție dublă (50 μl/godeu) utilizând o pipetă multi-canal. 2. Incubați o oră la 37ș
jrc2435as1994 by Guvernul României () [Corola-website/Law/87589_a_88376]
-
se titrează cu testul Elisa indirect. Diluții duble de antigen se titrează față de o diluție constantă (1/50) cu anticorp monoclonal 3-17-A3. Protocolul este următorul: PROCEDURA 1. Diluați antigen VBLA în PBS pe placa de microtitrare într-o serie de diluție dublă (50 μl/godeu) utilizând o pipetă multi-canal. 2. Incubați o oră la 37ș C pe un agitator orbital. 3. Spălați plăcile de trei ori cu PBS. 4. Adăugați 50 μl anticorp monoclonal 3-17-A3 (diluat 1/50) în fiecare godeu
jrc2435as1994 by Guvernul României () [Corola-website/Law/87589_a_88376]
-
agitator orbital. 9. Adăugați substrat și cromogen după descrierea anterioară. Opriți reacția după zece minute prin adăugarea a 1 M acid sulfuric (50 μl/godeu). La testul competitiv, anticorpul monoclonal trebuie să fie în exces, pentru aceasta fiind aleasă o diluție a antigenului care se încadrează în curba de titrare (nu în regiunea platoului) care dă aproximativ 0,8 OD după zece minute. Protocol pentru testul de imunodifuziune în gel de agar pentru depistarea anticorpilor împotriva bolii epizootice hemoragice Testul de
jrc2435as1994 by Guvernul României () [Corola-website/Law/87589_a_88376]
-
celule pe ml de extract final de cartof). Factorul critic pentru siguranța rezultatelor testului este calitatea antiserului. Doar antiserul cu un titru superior (minim 2000 pentru antiserul brut) este acceptabil și toate testele trebuie efectuate la titrul antiserului sau o diluție sub titru. Este preferată metoda indirectă. Metoda directă se poate aplica dacă testul are un nivel de sensibilitate și specificitate echivalente metodei indirecte. Testul IF are avantajul interpretării subiective a morfologiei colorației celulare și intensității fluorescenței care oferă informații asupra
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
ale tulpinii plantei de cartof sau tomată. Se pune în suspensie într-un volum mic de apă distilată sterilă sau un tampon fosfat de 50 mM. Se lasă 5 - 10 minute pe masă. 3.2. Se prepară o serie de diluții zecimale ale suspensiei, de exemplu 1/10 și 1/100 sau mai multe dacă se consideră necesar. 3.3. Se transferă un volum standard de suspensie și de diluții într-un mediu nutritiv comun (NA, YPGA și SPA, apendicele 1
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
10 minute pe masă. 3.2. Se prepară o serie de diluții zecimale ale suspensiei, de exemplu 1/10 și 1/100 sau mai multe dacă se consideră necesar. 3.3. Se transferă un volum standard de suspensie și de diluții într-un mediu nutritiv comun (NA, YPGA și SPA, apendicele 1) și/sau în mediul de tetrazoliu Kelman (apendicele 1) și/sau în mediul selectiv SMSA (apendicele 7). Se întinde sau se prepară în linii cu o tehnică de diluare
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
amidonului - Hidroliza esculinei - Producție de levan - Mediile și metodele se găsesc în Lelliott & Stead (1987) Testul IF Se prepară o suspensie de 106 celule pe ml din cultură și din sușa sau sușele de control. Se prepară o serie de diluții duble de antiser. Se aplică procedura IF (secțiunea III.2). Valoarea IF a culturii trebuie să fie echivalentă celei a controlului pozitiv. Testul ELISA Se prepară o suspensie de >106 celule pe ml din cultură și din sușa sau sușele
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
18°C (săptămâni) sau la - 70°C (luni). 2. Testul IF Se folosește antiserul pentru Ralstonia solanacearum, preferabil rasa 3/biovar 2. Se determină titrul unei suspensii de 106 celule pe ml din sușa omologă de Ralstonia solanacearum cu o diluție corespunzătoare de antiser conjugat cu izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Antiserul brut ar trebui să aibă o valoare IF de minim 1:2000. Se utilizează lame microscopice cu mai multe puțuri, de preferință cu 10 ferestre de minim
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
mărește pentru ferestre mai mari) din extractul concentrat resuspendat într-un șir de ferestre. Șirul rămas poate fi folosit ca duplicat sau pentru un al doilea eșantion, după cum se prezintă în figura 1. (ii) pentru alte extracte concentrate: Se pregătesc diluții zecimale de 1/10, 1/100 și 1/1 000 din extractul concentrat resuspendat în tamponul de concentrare. Se pipetează un volum standard (15 μl corespund unei ferestre de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru ferestre mai mari) din
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
100 și 1/1 000 din extractul concentrat resuspendat în tamponul de concentrare. Se pipetează un volum standard (15 μl corespund unei ferestre de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru ferestre mai mari) din extractul concentrat resuspendat și fiecare diluție într-un șir de ferestre. Șirul rămas poate fi folosit ca duplicat sau pentru un al doilea eșantion, după cum se prezintă în figura 2. 2.2. Se lasă picăturile să se usuce. Celulele bacteriene se fixează pe lamă prin încălzire
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
lasă picăturile să se usuce. Celulele bacteriene se fixează pe lamă prin încălzire, trecere prin flacără sau cu 95% etanol. 2.3 Procedura IF (i) În conformitate cu pregătirea lamei de test de la 2.1 pct. (i): se prepară un set de diluții duble ale antiserului în tampon IF (apendicele 3): 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T). (ii) În conformitate cu pregătirea lamei de test de la 2.1 pct. (ii): se
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
ale antiserului în tampon IF (apendicele 3): 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T). (ii) În conformitate cu pregătirea lamei de test de la 2.1 pct. (ii): se prepară diluția de lucru (WD) a antiserului în tampon IF. Diluția de lucru este diluția antiserului cu specificitate optimă și este de obicei jumătate din titru. Figura 1 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (i) și 2.3 pct. (i
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T). (ii) În conformitate cu pregătirea lamei de test de la 2.1 pct. (ii): se prepară diluția de lucru (WD) a antiserului în tampon IF. Diluția de lucru este diluția antiserului cu specificitate optimă și este de obicei jumătate din titru. Figura 1 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (i) și 2.3 pct. (i) Diluție standard a extractului concentrat resuspendat T = titru FITC
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T). (ii) În conformitate cu pregătirea lamei de test de la 2.1 pct. (ii): se prepară diluția de lucru (WD) a antiserului în tampon IF. Diluția de lucru este diluția antiserului cu specificitate optimă și este de obicei jumătate din titru. Figura 1 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (i) și 2.3 pct. (i) Diluție standard a extractului concentrat resuspendat T = titru FITC T/4 T/2
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
de lucru (WD) a antiserului în tampon IF. Diluția de lucru este diluția antiserului cu specificitate optimă și este de obicei jumătate din titru. Figura 1 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (i) și 2.3 pct. (i) Diluție standard a extractului concentrat resuspendat T = titru FITC T/4 T/2 T 2T => diluțiile duble ale antiserului Eșantionul 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 Figura 2 Pregătirea
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
specificitate optimă și este de obicei jumătate din titru. Figura 1 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (i) și 2.3 pct. (i) Diluție standard a extractului concentrat resuspendat T = titru FITC T/4 T/2 T 2T => diluțiile duble ale antiserului Eșantionul 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 Figura 2 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (ii) și 2.3 pct. (ii) FITC Diluție
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
diluțiile duble ale antiserului Eșantionul 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 Figura 2 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (ii) și 2.3 pct. (ii) FITC Diluție standard a antiserului pur pur 1/10 !/100 1/1000 => Diluțiile decimale ale extractului concentrat resuspendat Eșantionul 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 2.3.1. Se aranjează
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 Figura 2 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (ii) și 2.3 pct. (ii) FITC Diluție standard a antiserului pur pur 1/10 !/100 1/1000 => Diluțiile decimale ale extractului concentrat resuspendat Eșantionul 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 2.3.1. Se aranjează lamele pe hârtie absorbantă Se acoperă ferestrele de test cu diluția
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
Diluțiile decimale ale extractului concentrat resuspendat Eșantionul 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 2.3.1. Se aranjează lamele pe hârtie absorbantă Se acoperă ferestrele de test cu diluția sau diluțiile antiserului. În ferestrele FITC se aplică PBS. Volumul antiserului aplicat în ferestre trebuie să fie echivalent cu volumul extractului aplicat. 2.3.2. Se incubează acoperit timp de 30 de minute la temperatura camerei. 2.3.3. Se
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
ale extractului concentrat resuspendat Eșantionul 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 2.3.1. Se aranjează lamele pe hârtie absorbantă Se acoperă ferestrele de test cu diluția sau diluțiile antiserului. În ferestrele FITC se aplică PBS. Volumul antiserului aplicat în ferestre trebuie să fie echivalent cu volumul extractului aplicat. 2.3.2. Se incubează acoperit timp de 30 de minute la temperatura camerei. 2.3.3. Se scutură picăturile
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
minute în soluție tampon IF - Tween și apoi cinci minute în tampon IF (apendicele 3). Excesul de umezeală se îndepărtează cu grijă. 2.3.4. Se aranjează lamele pe hârtie absorbantă. Se acoperă ferestrele de test și fereastra FITC cu diluția conjugatului FITC utilizat pentru determinarea titrului. Volumul conjugatului aplicat în ferestre trebuie să fie echivalent cu volumul antiserului aplicat. 2.3.5. Se incubează acoperit timp de 30 de minute la temperatura camerei. 2.3.6. Se scutură picăturile de
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
sau contaminare. Notă: Dacă se observă acestea, testul trebuie repetat. Se observă celulele intens fluorescente cu morfologia caracteristică a Ralstonia solanacearum în ferestrele de test. Intensitatea fluorescenței trebuie să fie echivalentă cu cea a sușei de control pozitiv la aceeași diluție a antiserului. Celulele cu colorație incompletă sau cu fluorescență slabă nu trebuie luate în considerare, dacă nu sunt în număr mare (vezi interpretarea rezultatului testului IF). Interpretarea rezultatului testului IF: (i) Dacă nu sunt descoperite celule intens fluorescente cu morfologie
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
celule pe ml) de celule incomplet sau slab fluorescente în titrul antiserului, trebuie efectuat un al doilea test: - un test bazat pe un principiu biologic diferit sau - o repetare a testului IF, cu un al doilea antiser sau cu o diluție de zece ori a extractului concentrat. 3. Testul ELISA În baza Robinson - Smith et al., 1995 Se folosește antiser pentru Ralstonia solanacearum, preferabil rasa 3/biovar 2. Se determină titrul suspensiei de 106 celule pe ml din sușa omologă de
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
șC sau peste noapte la 4 șC. 3.4. Se scot extractele din puțuri. Se spală puțurile de trei ori cu PBS - Tween (apendicele 5), lăsând ultima soluție de spălare cel puțin cinci minute în puțuri. 3.5. Se prepară diluția corespunzătoare a antiserului de Ralstonia solanacearum în tampon de blocare (apendicele 5). Se aplică 100 μl de diluție de antiser în puțuri. Se incubează o oră la 37 șC. 3.6. Se scoate antiserul din puțuri. Se spală ca mai
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
trei ori cu PBS - Tween (apendicele 5), lăsând ultima soluție de spălare cel puțin cinci minute în puțuri. 3.5. Se prepară diluția corespunzătoare a antiserului de Ralstonia solanacearum în tampon de blocare (apendicele 5). Se aplică 100 μl de diluție de antiser în puțuri. Se incubează o oră la 37 șC. 3.6. Se scoate antiserul din puțuri. Se spală ca mai înainte (3.4). 3.7. Se prepară diluția corespunzătoare de conjugat de fosfatază alcalină în tampon de blocare
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]