331 matches
-
devierea standard a reproductibilității r: repetabilitatea R: reproductibilitatea CVr: coeficient de variație a repetabilității CVR: coeficient de variație a reproductibilității Figura 1: Aparat de extracție (4.8) PARTEA C DOZAREA TRIPTOFANULUI 1. Obiectul și domeniul de aplicare Metoda permite determinarea triptofanului total și liber din furaje. Ea nu face distincție între formele D și L. 2. Principiul Pentru determinarea triptofanului total, eșantionul se hidrolizează în mediu bazic cu o soluție de hidroxid de bariu saturată și se încălzește la 110oC timp
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
reproductibilității Figura 1: Aparat de extracție (4.8) PARTEA C DOZAREA TRIPTOFANULUI 1. Obiectul și domeniul de aplicare Metoda permite determinarea triptofanului total și liber din furaje. Ea nu face distincție între formele D și L. 2. Principiul Pentru determinarea triptofanului total, eșantionul se hidrolizează în mediu bazic cu o soluție de hidroxid de bariu saturată și se încălzește la 110oC timp de douăzeci de ore. După hidroliză, se adaugă etalonul intern. Pentru determinarea triptofanului liber, eșantionul se extrage în mediu
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
și L. 2. Principiul Pentru determinarea triptofanului total, eșantionul se hidrolizează în mediu bazic cu o soluție de hidroxid de bariu saturată și se încălzește la 110oC timp de douăzeci de ore. După hidroliză, se adaugă etalonul intern. Pentru determinarea triptofanului liber, eșantionul se extrage în mediu acid în prezența etalonului intern. Triptofanul și etalonul din hidrolizat și extract se determină prin CLHP cu ajutorul unui detector fluorimetric. 3. Reactivi 3.1. Se utilizează apă dublu distilată sau apă de calitate echivalentă
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
mediu bazic cu o soluție de hidroxid de bariu saturată și se încălzește la 110oC timp de douăzeci de ore. După hidroliză, se adaugă etalonul intern. Pentru determinarea triptofanului liber, eșantionul se extrage în mediu acid în prezența etalonului intern. Triptofanul și etalonul din hidrolizat și extract se determină prin CLHP cu ajutorul unui detector fluorimetric. 3. Reactivi 3.1. Se utilizează apă dublu distilată sau apă de calitate echivalentă (conductivitate < 10 μS/cm) 3.2. Substanța-etalon: triptofan (puritate/conținut ≥ 99%) uscat
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
în prezența etalonului intern. Triptofanul și etalonul din hidrolizat și extract se determină prin CLHP cu ajutorul unui detector fluorimetric. 3. Reactivi 3.1. Se utilizează apă dublu distilată sau apă de calitate echivalentă (conductivitate < 10 μS/cm) 3.2. Substanța-etalon: triptofan (puritate/conținut ≥ 99%) uscat sub vid pe pentoxid difosforic 3.3. Etalon intern propriu-zis: α-metil-triptofan (puritate/conținut ≥ 99%) uscat sub vid pe pentoxid difosforic 3.4. Hidroxid de bariu octahidratat (ar trebui să se evite expunerea excesivă a Ba(OH
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
se completează până la un litru cu apă 3.14. Acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l: se iau 34 ml de acid ortofosforic (3.6) și se completează până la un litru cu apă (3.1) 3.15. Soluție mamă de triptofan (3.2), c = 2,50 μmol/ml Într-un balon gradat de 500 ml, se dizolvă 0,2553 g de triptofan (3.2) în acid clorhidric (3.13) și se completează până la gradație cu acid clorhidric (3.13). Se depozitează
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
acid ortofosforic (3.6) și se completează până la un litru cu apă (3.1) 3.15. Soluție mamă de triptofan (3.2), c = 2,50 μmol/ml Într-un balon gradat de 500 ml, se dizolvă 0,2553 g de triptofan (3.2) în acid clorhidric (3.13) și se completează până la gradație cu acid clorhidric (3.13). Se depozitează la -18oC cel mult patru săptămâni. 3.16. Soluție-etalon intern concentrată, c = 2,50 μmol/ml Într-un balon gradat de
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
ml, se dizolvă 0,2728 g de α-metil-triptofan (3.3) în acid clorhidric (3.13) și se completează până la gradație cu acid clorhidric (3.13). Se depozitează la -18oC cel mult patru săptămâni. 3.17. Soluție etalon de calibrare a triptofanului și etalonului intern Se iau 2,00 ml din soluția mamă de triptofan (3.15) și 2,00 ml din soluția mamă etalon intern (de α-metil-triptofan) (3.16). Se diluează cu apă (3.1) și metanol (3.8), la un
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
3.13) și se completează până la gradație cu acid clorhidric (3.13). Se depozitează la -18oC cel mult patru săptămâni. 3.17. Soluție etalon de calibrare a triptofanului și etalonului intern Se iau 2,00 ml din soluția mamă de triptofan (3.15) și 2,00 ml din soluția mamă etalon intern (de α-metil-triptofan) (3.16). Se diluează cu apă (3.1) și metanol (3.8), la un volum aproximativ egal și cu aproximativ aceeași concentrație de metanol (10-30%) ca și
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
ridicat de umiditate trebuie uscate la aer, la o temperatură de maximum 50°C sau prin liofilizare înainte de măcinare. Eșantioanele cu un conținut ridicat de substanțe grase trebuie extrase prin eter de petrol (3.9) înainte de măcinare. 5.2. Determinarea triptofanului liber (extract) Se cântărește cu o precizie de 1 mg o cantitate adecvată (1-5 g) din eșantionul preparat (5.1) într-un balon conic. Se adaugă 100,0 ml de acid clorhidric, c = 0,1 mol/l (3.13) și
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
trece la etapa cromatografiei conform pct. 5.4. A se proteja soluția-etalon și extractele de lumina solară directă. Dacă nu este posibilă analizarea extractelor în ziua preparării, ele trebuie depozitate la 5°C cel mult trei zile. 5.3. Dozarea triptofanului total (hidrolizat) Se cântăresc cu o precizie de 0,2 mg între 0,1 și 1 g din eșantionul preparat (5.1) într-un balon de polipropilenă (4.4). Cantitatea de eșantion cântărită trebuie să aibă un conținut de azot
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
cu până la 1 000 ml cu apă (3.1). Debit: 1 ml/min Timp total de emulsie: cca. 34 min Lungimea undei de detectare: excitație: 280 nm; emisie 356 nm Volum de injecție: 20 μl. 6. Calculul rezultatelor = g de triptofan pentru 100 g de eșantion A = suprafața vârfului etalonului intern, soluția etalon de calibrare (3.17) B = suprafața vârfului de triptofan, extras (5.2) sau hidrolizat (5.3) C = volumul în ml (2 ml) al soluției mamă de triptofan (3
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
undei de detectare: excitație: 280 nm; emisie 356 nm Volum de injecție: 20 μl. 6. Calculul rezultatelor = g de triptofan pentru 100 g de eșantion A = suprafața vârfului etalonului intern, soluția etalon de calibrare (3.17) B = suprafața vârfului de triptofan, extras (5.2) sau hidrolizat (5.3) C = volumul în ml (2 ml) al soluției mamă de triptofan (3.15) adăugată la soluția de calibrare (3.17) D = concentrația în μmol/ml (= 2,50) a soluției mamă de triptofan (3
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
de triptofan pentru 100 g de eșantion A = suprafața vârfului etalonului intern, soluția etalon de calibrare (3.17) B = suprafața vârfului de triptofan, extras (5.2) sau hidrolizat (5.3) C = volumul în ml (2 ml) al soluției mamă de triptofan (3.15) adăugată la soluția de calibrare (3.17) D = concentrația în μmol/ml (= 2,50) a soluției mamă de triptofan (3.15) adăugată la soluția de calibrare (3.17) E = volumul în ml al soluției mamă etalon intern (3
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
de triptofan, extras (5.2) sau hidrolizat (5.3) C = volumul în ml (2 ml) al soluției mamă de triptofan (3.15) adăugată la soluția de calibrare (3.17) D = concentrația în μmol/ml (= 2,50) a soluției mamă de triptofan (3.15) adăugată la soluția de calibrare (3.17) E = volumul în ml al soluției mamă etalon intern (3.16) adăugată la extract (5.2) (= 5,00 ml) sau la hidrolizat (5.3) (=2,00 ml) F = suprafața vârfului etalonului
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
ml al soluției mamă etalon intern (3.16) adăugată la extract (5.2) (= 5,00 ml) sau la hidrolizat (5.3) (=2,00 ml) F = suprafața vârfului etalonului intern, extras (5.2) sau hidrolizat (5.3) G = suprafața vârfului de triptofan, soluția-etalon de calibrare (3.17) H = volumul în ml (= 2,00 ml) al soluției mamă etalon intern (3.16) adăugată la soluția etalon de calibrare (3.17) W = greutatea eșantionului în g (corectată pentru a obține greutatea inițială dacă produsul
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
2,00 ml) al soluției mamă etalon intern (3.16) adăugată la soluția etalon de calibrare (3.17) W = greutatea eșantionului în g (corectată pentru a obține greutatea inițială dacă produsul este uscat și/sau degresat) MW = greutatea moleculară a triptofanului (= 204,23) 7. Repetabilitatea Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele realizate pe același eșantion nu poate depăși 10% din rezultatul superior. 8. Rezultatele unui studiu interlaboratoare A fost realizat un studiu comunitar interlaboratoare (a patra intercomparație); au fost analizate
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
trei eșantioane de către 12 laboratoare pentru certificarea metodei prin hidroliză. Fiecare eșantion a fost supus la 5 analize. Rezultatele obținute se regăsesc în tabelul următor: Eșantionul 1 Eșantionul 2 Eșantion 3 Furaje pentru porcine Furaje pentru porcine completate cu L-triptofan Furaje concentrate pentru porcine L 12 12 12 n 50 55 50 Media [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
variație a devierii standard a repetabilității, în % CVR: coeficient de variație a devierii standard a reproductibilității, în % A fost realizat un alt studiu inter-laboratoare (a treia inter-comparație); au fost analizate două eșantioane de către treisprezece laboratoare pentru certificarea metodei prin extracția triptofanului liber. Fiecare eșantion a fost supus la cinci analize. Rezultatele se regăsesc în tabelul următor: Eșantion 4 Eșantion 5 Amestec de grâu și soia Amestec de grâu și soia (=eșantion 4) cu adaos de triptofan (0,457 g/kg) L
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
pentru certificarea metodei prin extracția triptofanului liber. Fiecare eșantion a fost supus la cinci analize. Rezultatele se regăsesc în tabelul următor: Eșantion 4 Eșantion 5 Amestec de grâu și soia Amestec de grâu și soia (=eșantion 4) cu adaos de triptofan (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Media [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [%] 1,34 1,34 sR [g/kg] 0
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
reproductibilitate CVr: coeficient de variație a devierii standard a repetabilității, în % CVR: coeficient de variație a devierii standard a reproductibilității, în % 9. Observații 9.1. Condițiile speciale de cromatografie prezentate mai jos pot conduce la o mai bună separare între triptofan și α-metil-triptofan. Eluție izocratică urmată de o curățare a coloanei pe gradient: Coloana pentru cromatografie lichidă: 125 mm x 4 mm, C18, particule de 5 μm, sau echivalent Temperatura coloanei: 32oC Faza mobilă: A: amestec 95/5 de KH2PO4, la
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
A 0% B Debit: 1,2 ml/min Timp total de eluție: cca. 33 min. 9.2. Cromatografia variază în funcție de tipul de CLHP și de umplerea coloanei. Sistemul reținut trebuie conducă la o întoarcere la linia de bază între vârfurile triptofanului și ale etalonului intern. În plus, este important ca produșii de descompunere să fie bine separați de triptofan și etalonul intern. Trebuie realizată o probă fără etalon intern astfel încât să se verifice absența impurităților pe linia de bază la nivelul
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
variază în funcție de tipul de CLHP și de umplerea coloanei. Sistemul reținut trebuie conducă la o întoarcere la linia de bază între vârfurile triptofanului și ale etalonului intern. În plus, este important ca produșii de descompunere să fie bine separați de triptofan și etalonul intern. Trebuie realizată o probă fără etalon intern astfel încât să se verifice absența impurităților pe linia de bază la nivelul etalonului intern. Este important ca timpul de eluție să fie suficient de lung pentru a permite eluția tuturor
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
de eluție pot interfera cu operațiile ulterioare de cromatografie. În gama operațiilor, sistemul cromatografic trebuie să dea un răspuns linear. Acest răspuns trebuie să fie măsurat la o concentrație constantă (concentrația normală) a etalonului intern și la diverse concentrații de triptofan. Este important că înălțimea vârfurilor triptofanului și ale etalonului intern să se situeze în gama lineară a sistemului CLHP/fluorescență. Dacă vârfurile triptofanului și/sau ale etalonului intern sunt prea mici sau prea mari, analiza trebuie reprodusă cu un eșantion
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]
-
ulterioare de cromatografie. În gama operațiilor, sistemul cromatografic trebuie să dea un răspuns linear. Acest răspuns trebuie să fie măsurat la o concentrație constantă (concentrația normală) a etalonului intern și la diverse concentrații de triptofan. Este important că înălțimea vârfurilor triptofanului și ale etalonului intern să se situeze în gama lineară a sistemului CLHP/fluorescență. Dacă vârfurile triptofanului și/sau ale etalonului intern sunt prea mici sau prea mari, analiza trebuie reprodusă cu un eșantion de o altă dimensiune și/sau
jrc4594as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89760_a_90547]