10,213 matches
-
fluorescentă este o reprezentare a intensității relative a emisiei fluorescente a unui compus, în funcție de lungimea de undă, atunci când lungimea de undă de excitație este păstrată la o valoare constantă, arătând eficiența relativă a emisiei fluorescente la diverse lungimi de undă. Spectrul de excitație al fluorescenței reprezintă dependența intensității relative a excitației în funcție de lungimea de undă, atunci când lungimea de undă de emisie rămâne constantă, arătând eficiența relativă a diferitelor lungimi de undă de a produce fluorescență. Experimentele de fluorescență aduc informații cu privire la
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
aduc informații cu privire la caracteristicile spectrale ale unor molecule: intensitatea de emisie fluorescentă, lungimea de undă a maximului de emisie, timpul de viață a fluorescenței, randamentul cuantic, deplasarea Stokes, anizotropia fluorescenței. Există o serie de factori, de natură diferită, care afectează spectrele de emisie fluorescentă a proteinelor aflate în soluții, maximul de emisie depinzând de acești factori. De exemplu, deplasarea maximului de emisie fluorescentă se datorează unor modificări apărute în solvent: redistribuirea electronilor în solvent, reorientarea moleculelor de solvent în jurul dipolilor stării
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
emisie depinzând de acești factori. De exemplu, deplasarea maximului de emisie fluorescentă se datorează unor modificări apărute în solvent: redistribuirea electronilor în solvent, reorientarea moleculelor de solvent în jurul dipolilor stării excitate sau interacțiunea dintre fluorofori și solvent. Influența solventului asupra spectrelor de fluorescență se traduce în informații despre mișcarea moleculelor, localizarea fluoroforilor legați de molecula respectivă sau de membrane. Spectrele de emisie fluorescentă sunt influențate și de transferul de energie, pH, temperatură și diverși detergenți. Temperatura este unul dintre factorii care
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
redistribuirea electronilor în solvent, reorientarea moleculelor de solvent în jurul dipolilor stării excitate sau interacțiunea dintre fluorofori și solvent. Influența solventului asupra spectrelor de fluorescență se traduce în informații despre mișcarea moleculelor, localizarea fluoroforilor legați de molecula respectivă sau de membrane. Spectrele de emisie fluorescentă sunt influențate și de transferul de energie, pH, temperatură și diverși detergenți. Temperatura este unul dintre factorii care afectează foarte puternic structura spațială a proteinelor, prin procesul de denaturare a conformației spațiale a proteinei. Denaturarea proteinelor poate
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
concentrație 10-5 M, care va fi utilizată pentru obținerea unei probe cu concentrația de HSA de 2 µM. Masa moleculară a proteinei HSA este de 66439 Da. 2. Modul de lucru Se va urmări denaturarea termică a HSA prin înregistrarea spectrelor de emisie a fluorescenței proteinei, între 25 oC și 85 oC, intervalul de creștere fiind de 5 oC. Înainte de înregistrarea spectrelor de emisie, proba va fi lăsată în cuvă, timp de 5 minute, pentru a ajunge la temperatura dorită. Temperatura
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
proteinei HSA este de 66439 Da. 2. Modul de lucru Se va urmări denaturarea termică a HSA prin înregistrarea spectrelor de emisie a fluorescenței proteinei, între 25 oC și 85 oC, intervalul de creștere fiind de 5 oC. Înainte de înregistrarea spectrelor de emisie, proba va fi lăsată în cuvă, timp de 5 minute, pentru a ajunge la temperatura dorită. Temperatura probei va fi monitorizată utilizând un dispozitiv de termostatare. După prepararea probelor, se vor seta parametrii experimentali, utilizând soft-ul spectrofluorimetrului
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
5 minute, pentru a ajunge la temperatura dorită. Temperatura probei va fi monitorizată utilizând un dispozitiv de termostatare. După prepararea probelor, se vor seta parametrii experimentali, utilizând soft-ul spectrofluorimetrului Perkin Elmer LS55. Astfel: se va accesa aplicația pentru înregistrarea spectrelor de emisie a fluorescenței; se va fixa lungimea de undă de excitație la 295 nm (pentru a minimiza excitarea tirozinelor din structura proteinei HSA) și se va culege informația spectrală pe intervalul, 300 nm 600 nm; se va seta sistemul
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
se va seta sistemul de fante ale monocromatoarelor de excitație și de emisie, astfel încât sensibilitatea și rezoluția spectrală să fie optime; se va alege o viteză de scanare de 500 nm/minut; se vor face 5 sau 10 acumulări de spectre, dacă raportul semnal/zgomot nu este acceptabil pentru o singură acumulare spectrală; se va crea un fișier pentru spectrul care va fi înregistrat; se va da comanda de înregistrare a spectrului de emsie. Atenție! Nu se va deschide compartimentul cuvei
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
fie optime; se va alege o viteză de scanare de 500 nm/minut; se vor face 5 sau 10 acumulări de spectre, dacă raportul semnal/zgomot nu este acceptabil pentru o singură acumulare spectrală; se va crea un fișier pentru spectrul care va fi înregistrat; se va da comanda de înregistrare a spectrului de emsie. Atenție! Nu se va deschide compartimentul cuvei în timpul manevrării soft-lui instrumentului. 3. Obținerea și interpretarea rezultatelor După setarea parametrilor experimentali, vor fi urmați pașii de mai
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
minut; se vor face 5 sau 10 acumulări de spectre, dacă raportul semnal/zgomot nu este acceptabil pentru o singură acumulare spectrală; se va crea un fișier pentru spectrul care va fi înregistrat; se va da comanda de înregistrare a spectrului de emsie. Atenție! Nu se va deschide compartimentul cuvei în timpul manevrării soft-lui instrumentului. 3. Obținerea și interpretarea rezultatelor După setarea parametrilor experimentali, vor fi urmați pașii de mai jos: se va înregistra spectrul de emisie a HSA (2 µM), pentru
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
se va da comanda de înregistrare a spectrului de emsie. Atenție! Nu se va deschide compartimentul cuvei în timpul manevrării soft-lui instrumentului. 3. Obținerea și interpretarea rezultatelor După setarea parametrilor experimentali, vor fi urmați pașii de mai jos: se va înregistra spectrul de emisie a HSA (2 µM), pentru fiecare valoare a temperaturii setate pe unitatea de termostatare (între 25 oC și 85 oC), așteptând un timp de 5 minute, pentru ca în compartimentul cuvei să fie atinsă temperatura de lucru; se va
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
µM), pentru fiecare valoare a temperaturii setate pe unitatea de termostatare (între 25 oC și 85 oC), așteptând un timp de 5 minute, pentru ca în compartimentul cuvei să fie atinsă temperatura de lucru; se va urmări renaturarea proteinei, prin trasarea spectrelor de emisie a fluorescenței HSA, între 85 oC și 25 oC.. Se vor reprezenta grafic dependențele maximelor intensităților de emisie fluorescentă, pentru cele două procese termice, denaturare și renaturare, în funcție de temperatură, la aceeași lungime de undă (corespunzătoare maximului emisiei fluorescente
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
fluorofori naturali ai proteinelor, în apă. Poziționarea maximului de emisie a proteinelor față de cel al Trp liber furnizează o serie de informații legate de structura împachetată a proteinei, ca urmare a influenței mediului în care se găsește proteina. Sunt prezentate spectrele de absorbție și de emisie fluorescentă pentru triptofan. După cum se observă, Trp-ul prezintă absorbție maximă la 280 nm. Spectrul de emisie fluorescentă arată că intensitatea de emisie este maximă la aproximativ 340 nm. De asemenea, prin suprapunerea celor două spectre
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
serie de informații legate de structura împachetată a proteinei, ca urmare a influenței mediului în care se găsește proteina. Sunt prezentate spectrele de absorbție și de emisie fluorescentă pentru triptofan. După cum se observă, Trp-ul prezintă absorbție maximă la 280 nm. Spectrul de emisie fluorescentă arată că intensitatea de emisie este maximă la aproximativ 340 nm. De asemenea, prin suprapunerea celor două spectre, este pusă în evidență deplasarea Stokes. Principalul motiv pentru care se studiază fluorescența intrinsecă a proteinelor este acela de
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
spectrele de absorbție și de emisie fluorescentă pentru triptofan. După cum se observă, Trp-ul prezintă absorbție maximă la 280 nm. Spectrul de emisie fluorescentă arată că intensitatea de emisie este maximă la aproximativ 340 nm. De asemenea, prin suprapunerea celor două spectre, este pusă în evidență deplasarea Stokes. Principalul motiv pentru care se studiază fluorescența intrinsecă a proteinelor este acela de a obține informații cu privire la conformația acestora, în diferite medii în care sunt dizolvate. Acest fapt este posibil, deoarece atât fluorescența Trp
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
natura și proprietățile solventului, pH-ul soluției, prezența sau absența unor ioni/molecule în soluția de proteină sau acțiunea radiațiilor ionizante. Unul dintre factorii importanți care influențează fluorescența proteinelor este polaritatea solventului. Poziția maximului emisiei fluorescente, așa cum se obține din spectrul de emisie, este sensibilă la polaritatea mediului și la mobilitatea fluoroforului în acest mediu. În general, starea excitată este mult mai polară decât cea fundamentală. În aceste condiții, moleculele excitate tind să interacționeze cu un solvent polar, ducând la alinierea
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
Astfel, modificarea poziției maximului de emisie poate fi utilizată ca măsură a polarității mediului înconjurător al fluoroforilor. În cazul fluorescenței Trp, intensitatea fluorescenței la λmax crește când polaritatea solventului scade. Mai jos este prezentat modul în care se poate modifica spectrul de emisie fluorescentă a unei proteine, sub influența modificărilor condițiilor de mediu. Atunci când fluorescența naturală a proteinelor nu este suficientă, în anumite experimente se folosesc fluorofori extrinseci, legați prin legături necovalente la proteine, pentru a îmbunătăți proprietățile fluorescente ale sistemului
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
să fie nesemnificativă, în soluții apoase. Interacțiunile proteinelor cu fluoroforul extrinsec, ANS, sunt folosite, de exemplu, pentru a detecta prezența stărilor molten globule din structura împachetată a proteinelor sau expunerea spre solvent a suprafețelor apolare din structura acestora. În urma examinării spectrelor fluoroforului. ANS și ale derivaților săi, s-a observat că, în medii nepolare, randamentul cuantic al fluorescenței acestor molecule crește semnificativ, iar spectrul se deplasează spre lungimi undă de emisie mai mici. Aceste efecte se manifestă și în solvenți cu
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
din structura împachetată a proteinelor sau expunerea spre solvent a suprafețelor apolare din structura acestora. În urma examinării spectrelor fluoroforului. ANS și ale derivaților săi, s-a observat că, în medii nepolare, randamentul cuantic al fluorescenței acestor molecule crește semnificativ, iar spectrul se deplasează spre lungimi undă de emisie mai mici. Aceste efecte se manifestă și în solvenți cu polaritatea scăzută, comparativ cu aceia care au o polaritate semnificativă. Metoda Scatchard pentru determinarea constantei de legare. Pentru a caracteriza tăria cu care
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
concentrația de ANS va fi cuprinsă între 0 și 20 µM. Pentru studiul interacțiunii HSA ANS, se vor prepara probele. 2. Modul de lucru Se va urmări interacțiunea dintre proteina HSA și ligandul ANS, prin metoda de spectroscopie de fluorescență. Spectrele de emisie fluorescentă vor fi obținute cu spectrofluorimetrul Perkin Elmer LS55. Selectarea condițiilor pentru înregistrarea spectrelor de fluorescență reprezintă o etapă importantă a experimentului. Ca urmare, se va alege un sistem de fante pentru monocromatoarele de excitație și de emisie
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
se vor prepara probele. 2. Modul de lucru Se va urmări interacțiunea dintre proteina HSA și ligandul ANS, prin metoda de spectroscopie de fluorescență. Spectrele de emisie fluorescentă vor fi obținute cu spectrofluorimetrul Perkin Elmer LS55. Selectarea condițiilor pentru înregistrarea spectrelor de fluorescență reprezintă o etapă importantă a experimentului. Ca urmare, se va alege un sistem de fante pentru monocromatoarele de excitație și de emisie care să confere atât rezoluție, cât și sensibilitate optime. Spectrele de emisie fluorescentă vor fi înregistrate
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
Elmer LS55. Selectarea condițiilor pentru înregistrarea spectrelor de fluorescență reprezintă o etapă importantă a experimentului. Ca urmare, se va alege un sistem de fante pentru monocromatoarele de excitație și de emisie care să confere atât rezoluție, cât și sensibilitate optime. Spectrele de emisie fluorescentă vor fi înregistrate cu o viteză de scanare de 500 nm/min. Se va alege, pentru excitarea Trplui, lungimea de undă de 295 nm (evitând astfel culegerea datelor de emisie și pentru Tyr), iar intervalul de scanare
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
emisie fluorescentă vor fi înregistrate cu o viteză de scanare de 500 nm/min. Se va alege, pentru excitarea Trplui, lungimea de undă de 295 nm (evitând astfel culegerea datelor de emisie și pentru Tyr), iar intervalul de scanare pentru spectrul de emisie va fi cuprins între 300 nm și 500 nm. Dacă este necesar, se vor face 5 10 acumulări spectrale, pentru a se îmbunătăți raportul semnal/zgomot. 3. Obținerea și interpretarea rezultatelor După setarea parametrilor experimentali, vor fi urmați
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
nm și 500 nm. Dacă este necesar, se vor face 5 10 acumulări spectrale, pentru a se îmbunătăți raportul semnal/zgomot. 3. Obținerea și interpretarea rezultatelor După setarea parametrilor experimentali, vor fi urmați pașii de mai jos: Se vor înregistra spectrele de absorbție pentru proteina HSA (2 µM) și pentru ligandul ANS (2 µM) și se vor determina lungimile de undă la care apar maximele spectrale. Se vor înregistra spectrele de emisie fluorescentă pentru HSA și ANS, aflate în soluții separate
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
experimentali, vor fi urmați pașii de mai jos: Se vor înregistra spectrele de absorbție pentru proteina HSA (2 µM) și pentru ligandul ANS (2 µM) și se vor determina lungimile de undă la care apar maximele spectrale. Se vor înregistra spectrele de emisie fluorescentă pentru HSA și ANS, aflate în soluții separate. Se va observa că proteina prezintă emisie fluorescentă (datorată cromoforilor intrinseci), în timp ce fluorescența ANS este, practic, insesizabilă. Se vor înregistra spectrele de emisie fluorescentă pentru probele preparate pentru studiul
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]