9,135 matches
-
Cerințele de specificitate a antiserului sunt extrem de mari. Testul ELISA nu poate fi folosit ca test de triere unic. 6 Testul PCR PCR are potențialul unei detectări foarte sensibile, deși testul este ușor inhibat de componente de plantă sau de extract de cartof ducând la un rezultat negativ fals. Unii cultivari de cartof conțin mai mulți inhibitori decât alții. De aceea este necesară îndepărtarea acestor inhibitori. Inhibiția se poate reduce prin diluare, dar se diluează și populația de Ralstonia solanacearum. Trebuie
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
la teste pozitive false. Testele pozitive false pot să apară de asemenea din omologie de secvențe cu alte organisme. Din aceste motive, testul direct PCR nu poate fi folosit ca test unic de triere. 7 Testul de îmbogățire Eșantioanele de extract final de cartof incubat în mediu nutritiv semi-selectiv, cum este mediul nutrivitv modificat SMSA, permite multiplicarea Ralstonia solanacearum. Poate mult mai important este faptul că, de asemenea, diluează potențialii inhibitori ai testelor ELISA sau PCR. Astfel, Ralstonia solanacearum în mediu
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
un potențial bun. Cu toate acestea, datorită relativei lipse de experiență în lucrul cu ele, nu pot fi utilizate ca metode unice de detectare. 8 Testul de probă biologică Testul de probă biologică este folosit pentru izolarea Ralstonia solanacearum din extractele finale de cartof prin îmbogățire selectivă într-o plantă gazdă și nu poate fi făcut pe plante de tomate sau vinete. Testul solicită condiții optime de incubare specificate în prezenta metodă. Bacteriile inhibitoare ale Ralstonia solanacearum în mediul SMSA probabil
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
ÎN EȘANTIOANELE DE TUBERCULI DE CARTOF Notă: Mărimea standard a eșantionului este de 200 de tuberculi. Cu toate acestea procedura se poate aplica în mod convenabil eșantioanelor cu mai puțin de 200 de tuberculi. 1. Pregătirea eșantionului pentru testare Notă: Extractul final de cartof obținut în această procedură poate fi utilizate de asemenea pentru detectarea Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Opțiuni de pre-testare dacă sunt considerate utile: (i) se incubează eșantionul la 25 - 30°C până la două săptămâni pentru a încuraja multiplicarea
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
Se centrifughează maceratul decantat sau supranatantul din prima etapă de centrifugare la 7 000 g timp de 15 minute sau la 10 000 g timp de 10 minute la o temperatură sub 10°C. Se îndepărtează supranatantul fără a deranja extractul concentrat. (ii) Se filtrează maceratul printr-un sistem de filtrare cu mărimea porilor de 40 - 100 μm. Se accelerează filtrarea utilizând o pompă de vid. Se colectează filtratul într-un tub de centrifugare. Se spală filtrul cu tamponul de macerare
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
centrifugare. Se spală filtrul cu tamponul de macerare. Se centrifughează filtratul la 7 000 g timp de 15 minute sau la 10 000 g timp de 10 minute la o temperatură sub 10°C. Se îndepărtează supranatantul fără a deranja extractul concentrat. 1.5 Se face o nouă suspensie a extractului concentrat în 1 ml de tampon de concentrare (apendicele 2). Se împarte în două părți egale și se transferă fiecare parte într-o microfiolă. Una dintre microfiole se folosește pentru
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
filtratul la 7 000 g timp de 15 minute sau la 10 000 g timp de 10 minute la o temperatură sub 10°C. Se îndepărtează supranatantul fără a deranja extractul concentrat. 1.5 Se face o nouă suspensie a extractului concentrat în 1 ml de tampon de concentrare (apendicele 2). Se împarte în două părți egale și se transferă fiecare parte într-o microfiolă. Una dintre microfiole se folosește pentru testare. Restul extractului se conservă pe perioada testelor la temperatura
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
5 Se face o nouă suspensie a extractului concentrat în 1 ml de tampon de concentrare (apendicele 2). Se împarte în două părți egale și se transferă fiecare parte într-o microfiolă. Una dintre microfiole se folosește pentru testare. Restul extractului se conservă pe perioada testelor la temperatura de 4°C. Se adaugă 10 - 25% (v/v) glicerol steril în cealaltă microfiolă. Se centrifughează. Se depozitează la - 18°C (săptămâni) sau la - 70°C (luni). 2. Testul IF Se folosește antiserul
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
o suspensie de 106 celule pe ml dintr-o sușă corespunzătoare de rasă / biovar de Ralstonia solanacearum. Se utilizează o lamă la fiecare set de teste. 2.1. Lamele de test se prepară printr-una dintre următoarele proceduri: (i) pentru extracte concentrate cu relativ puțin amidon: Se pipetează un volum standard (15 μl este adecvat unei ferestre de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru ferestre mai mari) din extractul concentrat resuspendat într-un șir de ferestre. Șirul rămas poate fi
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
de test se prepară printr-una dintre următoarele proceduri: (i) pentru extracte concentrate cu relativ puțin amidon: Se pipetează un volum standard (15 μl este adecvat unei ferestre de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru ferestre mai mari) din extractul concentrat resuspendat într-un șir de ferestre. Șirul rămas poate fi folosit ca duplicat sau pentru un al doilea eșantion, după cum se prezintă în figura 1. (ii) pentru alte extracte concentrate: Se pregătesc diluții zecimale de 1/10, 1/100
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
mm diametru - volumul se mărește pentru ferestre mai mari) din extractul concentrat resuspendat într-un șir de ferestre. Șirul rămas poate fi folosit ca duplicat sau pentru un al doilea eșantion, după cum se prezintă în figura 1. (ii) pentru alte extracte concentrate: Se pregătesc diluții zecimale de 1/10, 1/100 și 1/1 000 din extractul concentrat resuspendat în tamponul de concentrare. Se pipetează un volum standard (15 μl corespund unei ferestre de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
de ferestre. Șirul rămas poate fi folosit ca duplicat sau pentru un al doilea eșantion, după cum se prezintă în figura 1. (ii) pentru alte extracte concentrate: Se pregătesc diluții zecimale de 1/10, 1/100 și 1/1 000 din extractul concentrat resuspendat în tamponul de concentrare. Se pipetează un volum standard (15 μl corespund unei ferestre de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru ferestre mai mari) din extractul concentrat resuspendat și fiecare diluție într-un șir de ferestre. Șirul
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
zecimale de 1/10, 1/100 și 1/1 000 din extractul concentrat resuspendat în tamponul de concentrare. Se pipetează un volum standard (15 μl corespund unei ferestre de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru ferestre mai mari) din extractul concentrat resuspendat și fiecare diluție într-un șir de ferestre. Șirul rămas poate fi folosit ca duplicat sau pentru un al doilea eșantion, după cum se prezintă în figura 2. 2.2. Se lasă picăturile să se usuce. Celulele bacteriene se
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
a antiserului în tampon IF. Diluția de lucru este diluția antiserului cu specificitate optimă și este de obicei jumătate din titru. Figura 1 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (i) și 2.3 pct. (i) Diluție standard a extractului concentrat resuspendat T = titru FITC T/4 T/2 T 2T => diluțiile duble ale antiserului Eșantionul 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 Figura 2 Pregătirea lamei de test
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 Figura 2 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (ii) și 2.3 pct. (ii) FITC Diluție standard a antiserului pur pur 1/10 !/100 1/1000 => Diluțiile decimale ale extractului concentrat resuspendat Eșantionul 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 2.3.1. Se aranjează lamele pe hârtie absorbantă Se acoperă ferestrele de test cu diluția sau diluțiile antiserului
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
7 ●8 ●9 ●10 2.3.1. Se aranjează lamele pe hârtie absorbantă Se acoperă ferestrele de test cu diluția sau diluțiile antiserului. În ferestrele FITC se aplică PBS. Volumul antiserului aplicat în ferestre trebuie să fie echivalent cu volumul extractului aplicat. 2.3.2. Se incubează acoperit timp de 30 de minute la temperatura camerei. 2.3.3. Se scutură picăturile de antiser de pe lamă și se clătesc lamele cu atenție cu un tampon IF. Se spală timp de cinci
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
celule intens fluorescente cu morfologie caracteristică, atunci testul IF este negativ. (ii) Dacă sunt descoperite celule intens fluorescente cu morfologie caracteristică, se determină numărul mediu de celule pe câmp microscopic și se calculează numărul de celule (N) pe ml de extract concentrat resuspendat (apendicele 4). O populație de aproximativ 10³ celule pe ml de extract concentrat resuspendat este considerată a fi limita de sensibilitate pentru testul IF, - pentru eșantioane cu N > 10³ celule pe ml de extract concentrat resuspendat, testul IF
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
descoperite celule intens fluorescente cu morfologie caracteristică, se determină numărul mediu de celule pe câmp microscopic și se calculează numărul de celule (N) pe ml de extract concentrat resuspendat (apendicele 4). O populație de aproximativ 10³ celule pe ml de extract concentrat resuspendat este considerată a fi limita de sensibilitate pentru testul IF, - pentru eșantioane cu N > 10³ celule pe ml de extract concentrat resuspendat, testul IF este considerat pozitiv, - pentru eșantioane cu N < 10³ celule pe ml de extract concentrat
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
N) pe ml de extract concentrat resuspendat (apendicele 4). O populație de aproximativ 10³ celule pe ml de extract concentrat resuspendat este considerată a fi limita de sensibilitate pentru testul IF, - pentru eșantioane cu N > 10³ celule pe ml de extract concentrat resuspendat, testul IF este considerat pozitiv, - pentru eșantioane cu N < 10³ celule pe ml de extract concentrat resuspendat testul IF poate fi considerat pozitiv, (iii) dacă se observă un număr mare (>105 celule pe ml) de celule incomplet sau
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
de extract concentrat resuspendat este considerată a fi limita de sensibilitate pentru testul IF, - pentru eșantioane cu N > 10³ celule pe ml de extract concentrat resuspendat, testul IF este considerat pozitiv, - pentru eșantioane cu N < 10³ celule pe ml de extract concentrat resuspendat testul IF poate fi considerat pozitiv, (iii) dacă se observă un număr mare (>105 celule pe ml) de celule incomplet sau slab fluorescente în titrul antiserului, trebuie efectuat un al doilea test: - un test bazat pe un principiu
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
incomplet sau slab fluorescente în titrul antiserului, trebuie efectuat un al doilea test: - un test bazat pe un principiu biologic diferit sau - o repetare a testului IF, cu un al doilea antiser sau cu o diluție de zece ori a extractului concentrat. 3. Testul ELISA În baza Robinson - Smith et al., 1995 Se folosește antiser pentru Ralstonia solanacearum, preferabil rasa 3/biovar 2. Se determină titrul suspensiei de 106 celule pe ml din sușa omologă de Ralstonia solanacearum. Se recomandă folosirea
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
et al., 1995 Se folosește antiser pentru Ralstonia solanacearum, preferabil rasa 3/biovar 2. Se determină titrul suspensiei de 106 celule pe ml din sușa omologă de Ralstonia solanacearum. Se recomandă folosirea plăcilor de microtritrare NUNC - Polysorb. Se include un extract de cartof de control negativ și un control salin tamponat fosfatic (PBS). Se folosește o suspensie de > 106 celule pe ml dintr-o sușă corespunzătoare de rasă/biovar de Ralstonia solanacearum drept control pozitiv. Se testează în mod identic cu
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
pe ml dintr-o sușă corespunzătoare de rasă/biovar de Ralstonia solanacearum drept control pozitiv. Se testează în mod identic cu eșantionul sau eșantioanele, dar separat de eșantioanele de pe placa de microtitru. 3.1. Se pipetează 100 - 200 μl din extractul concentrat resuspendat într-o microfiolă. Se încălzește timp de 4 minute la 100 șC. Se pune microfiola la gheață. 3.2. Se adaugă un volum egal de tampon de acoperire din carbonat dublu concentrat (apendicele 5). Se centrifughează. 3.3
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
dublu concentrat (apendicele 5). Se centrifughează. 3.3. Se aplică 100 μl alicote fiecăreia dintre minim ultimele două puțuri ale plăcii de microtitrare. Se incubează o oră la 37 șC sau peste noapte la 4 șC. 3.4. Se scot extractele din puțuri. Se spală puțurile de trei ori cu PBS - Tween (apendicele 5), lăsând ultima soluție de spălare cel puțin cinci minute în puțuri. 3.5. Se prepară diluția corespunzătoare a antiserului de Ralstonia solanacearum în tampon de blocare (apendicele
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
Se prepară o suspensie de 106 celule pe ml dintr-o sușă din rasa 3 / biovar 2 de Ralstonia solanacearum drept control pozitiv. Se testează într-un mod identic cu eșantionul sau eșantioanele. 4.1. Se pipetează 100 μl din extractul concentrat resuspendat într-o microfiolă. În mod alternativ, se tranferă 90 μl din extractul concentrat resuspendat într-o microfiolă conținând 10 μl de 0,5M de NaOH. Se amestecă întorcând în mod repetat microfiola. 4.2. Se încălzește timp de
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]