7,100 matches
-
picăturile de pe fiecare lamă și se clătește cu grijă într-o soluție tampon pentru imunofluorescență. Se spală prin imersie timp de cinci minute într-o soluție tampon IF-Tween (a se vedea apendicele 3), apoi încă cinci minute într-o soluție tampon IF. Se evită orice vaporizare sau vărsare care ar putea determina o contaminare încrucișată. Se elimină cu atenție excesul de umiditate cu ajutorul hârtiei sugative; 4.3.4. se așază lamele pe hârtie umedă. Se acoperă ferestrele de test cu conjugat
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
sau care prezintă o fluorescență slabă nu trebuie luate în considerare. La cea mai mică suspiciune de contaminare, testul trebuie repetat. Acest lucru se poate întâmpla în cazul în care toate lamele dintr-un lot prezintă celule pozitive din cauza contaminării tamponului sau în cazul în care celulele pozitive sunt izolate (în exteriorul ferestrelor) pe mediul de montare al lamei. 4.4.3. Există un anumit număr de probleme inerente specificității testului de imunofluorescență. Există un risc ridicat ca în extractele de
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
cu ocazia testelor de depistare a C. m. ssp. sepedonicus. Ca martori pozitivi se prepară suspensii care conțin între 105 și 106 celule/ml de C. m. ssp. sepedonicus (sușe NCPPB 4053 sau PD 406, de exemplu) într-o soluție tampon fosfatată la 0,01 M, pe baza unei culturi de trei până la cinci zile (a se vedea apendicele 2 pentru preparare). Se prepară lame martori pozitivi distincte ale sușei omoloage sau ale oricărei alte sușe de referință de C. m.
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
și se lasă la incubat toată noaptea la 4 °C. Se mai poate utiliza ca fixativ etanol la 96 %. În acest caz, extractul concentrat menționat la punctul 5.1.2 se dizolvă într-un amestec format din 50 μl de tampon fosfatat la 0,01 M și din 50 μl etanol la 96 %. Se amestecă la vortex și se lasă la incubat la 4 °C timp de 30-60 minute. 5.1.4. Se pune la centrifugat timp de 8 minute la
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
lasă la incubat la 4 °C timp de 30-60 minute. 5.1.4. Se pune la centrifugat timp de 8 minute la 7 000 g, se elimină lichidul supernatant și se repune în suspensie extractul concentrat în 75 μl de tampon fosfatat la 0,01 M. 5.1.5. Se depun 16 μl de suspensii fixate pe o lamă multitest, astfel cum se indică în figura 3. Pe fiecare lamă se aplică două probe diferite, nediluate, și din acestea se diluează
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
5. Se depun 16 μl de suspensii fixate pe o lamă multitest, astfel cum se indică în figura 3. Pe fiecare lamă se aplică două probe diferite, nediluate, și din acestea se diluează 10 μl la 1:100 (într-un tampon fosfatat de 0,01 M). Restul soluției de probă (49 μl) poate fi conservată la -20 °C, după ce s-a adăugat o cantitate de etanol la 96 %. În cazul în care este necesară repetarea testului FISH, se elimină etanolul prin
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
49 μl) poate fi conservată la -20 °C, după ce s-a adăugat o cantitate de etanol la 96 %. În cazul în care este necesară repetarea testului FISH, se elimină etanolul prin centrifugare și se înlocuiește cu o cantitate echivalentă de tampon fosfatat la 0,01 M (se omogenizează prin agitare). Figura 3. Dispunerea unei lame pentru testul FISH ***[PLEASE INSERT FIGURE AND THE FOLLOWING TEXT IN RO LANGUAGE]*** échantillon 1 = eșantion 1 témoin = martor témoin = martor témoin = martor échantillon 2 = eșantion
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
adăpost de praf, într-un loc uscat și la temperatura mediului ambiant. 5.2. Prehibridizare și hibridizare 5.2.1. Se prepară o soluție de lizozimă având la bază 10 mg de lizozimă (Sigma L-6876) pentru 10 ml de tampon (100 mM Tri-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Soluția menționată poate fi conservată, dar nu trebuie congelată, nici dezghețată, decât o singură dată. Fiecare eșantion se acoperă integral cu aproximativ 50 μl de soluție de lizozimă și se lasă
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
se lasă la incubat timp de 10 minute la temperatura aerului ambiant, apoi lamele se scufundă o singură dată în apa demineralizată și se usucă cu hârtie de filtru. O altă posibilitate: în fiecare godeu, în locul lizozimei, se adaugă la tamponul (2mM Tri-HCl, 2mM Cacl2, pH 7,4) 50 μl de proteinază K la 40-400 μg/ml, apoi se lasă la incubat la 37 °C timp de 30 de minute. 5.2.2. Se deshidratează celulele prin băi succesive de etanol
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
o fluorescență slabă nu trebuie luate în considerare. 5.3.3. La cea mai mică suspiciune de contaminare, testul trebuie repetat. Acest lucru se poate întâmpla în cazul în care toate lamele dintr-un lot prezintă celule pozitive din cauza contaminării tamponului sau în cazul în care celulele pozitive sunt izolate (în exteriorul ferestrelor) pe mediul de montare al lamei. 5.3.4. Există un anumit număr de probleme inerente specificității testului FISH. Este posibil ca în extractele de conuri de stoloni
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
-ului) trebuie tratați întotdeauna ca probe finale în procedură, pentru a evidenția apariția unui eventual transfer de ADN. În testul PCR trebuie incluși următorii martori negativi: - extract de probă care a dat anterior rezultate negative pentru C. m. ssp. sepedonicus; - tampoane martori folosite pentru a extrage bacteria și ADN-ul din probă; - amestec reactiv pentru PCR. De asemenea, trebuie incluși aici și următorii martori pozitivi: - alicote de extracte finale repuse în suspensie, după ce s-a adăugat C. m. ssp. sepedonicus (a
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
a concentra ADN-ul țintă în extractul de probă. Următoarea metodă a fost optimizată pentru a fi utilizată cu metoda PCR validată, descrisă de apendicele 6. 6.1. (a) Metoda Pastrik (2000) 1. Se pun cu pipeta 220 μl de tampon de liză (100 mM NaCl, 10mM Tri-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0] într-un tub Eppendorf de 1,5 ml. 2. Se adaugă 100 μl de extract de probă și se așază într-un bloc de
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
6.3. Analiza produsului reacției PCR 6.3.1. Se decodează amplimerii prin electroforeză pe gel de agaroză. O cantitate de cel puțin 12 μl de amestec reactiv de ADN amplificat, provenit de la fiecare probă, asociat cu 3 μl de tampon de încărcare (apendicele 6) se supun unei tensiuni de 5-8 V/cm pe geluri de agaroză la 2,0 % într-un tampon de EDTA (TAE) triacetat (apendicele 6). Se utilizează un marker de ADN adecvat, precum "100 bp ladder". 6
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
puțin 12 μl de amestec reactiv de ADN amplificat, provenit de la fiecare probă, asociat cu 3 μl de tampon de încărcare (apendicele 6) se supun unei tensiuni de 5-8 V/cm pe geluri de agaroză la 2,0 % într-un tampon de EDTA (TAE) triacetat (apendicele 6). Se utilizează un marker de ADN adecvat, precum "100 bp ladder". 6.3.2. Pentru a scoate în evidență benzile de ADN se folosește colorarea cu bromură de etidiu (la 0,5 mg/l
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
noi se verifică autenticitatea amplimerului, efectuând o analiză de restricție enzimatică pe o probă din ADN-ul amplificat rămas. În acest scop, se lasă la incubat la o temperatură optimă și pe o durată optimă, folosind o enzimă și un tampon corespunzătoare (a se vedea apendicele 6). Se decodează fragmentele digerate prin electroforeză pe gel de agaroză, în conformitate cu metoda indicată anterior și se vizualizează prin diafanoscopie sub UV dispunerea caracteristică a fragmentelor după restricția enzimatică și colorarea cu bromură de etidiu
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
care este posibil, cu extract din tubercul infectat în mod natural (a se vedea secțiunea 4). 7.6. Ca martori negativi, se inoculează cinci plante prin aceeași metodă (a se vedea punctul 7.3 sau 7.4) cu o soluție tampon sterilă de extract concentrat. 7.7. Se lasă plantele la incubat până la patru săptămâni la temperaturi între 18 °C și 24 °C, în spații adaptate la condițiile de carantină. În timpul incubației se menține o lumină suficientă și un grad ridicat
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
1. Desfășurare pe medii selective 8.1.1. Pe baza a 100 μl de alicotă de probă de extract concentrat de cartof repus în suspensie sau de sevă de pătlăgea vânătă, se efectuează diluții la a zecea parte într-un tampon de extract concentrat (a se vedea apendicele 3). 8.1.2. Tentativele de izolare pe bază de extract concentrat nediluat de cartof se soldează, în general, cu eșecuri datorită dificultăților pe care le prezintă cultura de Cms și a concurenței
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
Producție de acid pe bază de ramnoză - Producție de acid pe bază de salicină - Colorare Gram (a se vedea apendicele 9) + 9.2. Test de imunofluorescență (IF) (a) Se prepară o suspensie de aproximativ 106 celule pe mililitru într-un tampon de imunofluorescență (a se vedea apendicele 3). (b) Se prepară o diluție la jumătate dintr-un antiser adecvat. (c) Se urmează procedura testului de imunofluorescență (a se vedea secțiunea 4). (d) Pentru ca un test IF să fie pozitiv, titrul obținut
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
10.4. Se asigură izolarea față de plantele simptomatice, prelevând o secțiune de tulpină la o înălțime de 2 cm deasupra punctului de inoculare. Se reduce și se pune în suspensie într-o cantitate mică de apă distilată sterilă sau de tampon fosfatat la 50 mM (a se vedea apendicele 3). Se izolează de suspensie, diluând prin însămânțare simplă sau în striuri pe MTNA și YPGA (a se vedea apendicele 5), se lasă la incubat timp de trei-cinci zile la o temperatură
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
depistare PCR/IF și FISH Se pune în cultură timp de 72 de ore o sușă virulentă de C. m. ssp. sepedonicus [NCPPB 4053 sau PD 406] pe un mediu de bază MTNA și se pune în suspensie într-un tampon fosfatat la 10 mM, astfel încât să se obțină o densitate celulară de aproximativ 1-2 x 108 UFC pe mililitru. Aceasta corespunde, în general, unei suspensii ușor turbide care prezintă o densitate optică de 0,20-600 nm. Se prelevează un con
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
negativi ai fiecărei serii de probe. În cazul testelor IF, FISH și PCR, C. m. ssp. sepedonicus trebuie detectat la martorii pozitivi la cel puțin 106 și 104 celule/ml și trebuie să lipsească complet la martorii negativi. Apendicele 3 Tampoane pentru procedurile de testare GENERALITATE: tampoanele sterilizate care nu sunt deschise pot fi depozitate timp de maximum un an. 1. Tampoane pentru procedura de extragere 1.1. Tampon de extragere (tampon fosfatat la 50 mM, pH 7,0) Tamponul menționat
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
În cazul testelor IF, FISH și PCR, C. m. ssp. sepedonicus trebuie detectat la martorii pozitivi la cel puțin 106 și 104 celule/ml și trebuie să lipsească complet la martorii negativi. Apendicele 3 Tampoane pentru procedurile de testare GENERALITATE: tampoanele sterilizate care nu sunt deschise pot fi depozitate timp de maximum un an. 1. Tampoane pentru procedura de extragere 1.1. Tampon de extragere (tampon fosfatat la 50 mM, pH 7,0) Tamponul menționat este utilizat pentru extragerea, prin omogenizare
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
pozitivi la cel puțin 106 și 104 celule/ml și trebuie să lipsească complet la martorii negativi. Apendicele 3 Tampoane pentru procedurile de testare GENERALITATE: tampoanele sterilizate care nu sunt deschise pot fi depozitate timp de maximum un an. 1. Tampoane pentru procedura de extragere 1.1. Tampon de extragere (tampon fosfatat la 50 mM, pH 7,0) Tamponul menționat este utilizat pentru extragerea, prin omogenizare sau agitare, a bacteriei prezente în țesuturile plantei. Na2HPO4 (anhidru) 4,26 g KH2PO4 2
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
celule/ml și trebuie să lipsească complet la martorii negativi. Apendicele 3 Tampoane pentru procedurile de testare GENERALITATE: tampoanele sterilizate care nu sunt deschise pot fi depozitate timp de maximum un an. 1. Tampoane pentru procedura de extragere 1.1. Tampon de extragere (tampon fosfatat la 50 mM, pH 7,0) Tamponul menționat este utilizat pentru extragerea, prin omogenizare sau agitare, a bacteriei prezente în țesuturile plantei. Na2HPO4 (anhidru) 4,26 g KH2PO4 2,72 g Apă distilată 1,00 l
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
trebuie să lipsească complet la martorii negativi. Apendicele 3 Tampoane pentru procedurile de testare GENERALITATE: tampoanele sterilizate care nu sunt deschise pot fi depozitate timp de maximum un an. 1. Tampoane pentru procedura de extragere 1.1. Tampon de extragere (tampon fosfatat la 50 mM, pH 7,0) Tamponul menționat este utilizat pentru extragerea, prin omogenizare sau agitare, a bacteriei prezente în țesuturile plantei. Na2HPO4 (anhidru) 4,26 g KH2PO4 2,72 g Apă distilată 1,00 l Se dizolvă ingredientele
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]