7,100 matches
-
agitator rotativ (50-100 turații/minut) timp de 4 ore la o temperatură mai mică de 24 °C sau la o temperatură de refrigerare timp de 16-24 ore sau (b) Taloanele se omogenizează cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extracție (apendicele 4) într-un mixer (de exemplu, Waring sau Ultra Thurax) sau se mărunțesc într-un sac de macerare de unică folosință sigilat (de exemplu, sac Stomacher sau de tip "Bioreba strong gauge polythene" de 150 mm x
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
în care acesta este prea tulbure, se filtrează printr-o centrifugare la viteză mică (la 180 g maximum timp de zece minute, la o temperatură de 4-10 °C) sau printr-o filtrare în vid (40-100 μm), spălând filtrul cu un tampon de macerare suplimentar (10 ml). 1.1.4. Se centrifughează maceratul decantat la 7 000 g timp de 15 minute (sau la 10 000 g timp de zece minute) la o temperatură de 4-10 °C și se îndepărtează supranatantul fără
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
minute (sau la 10 000 g timp de zece minute) la o temperatură de 4-10 °C și se îndepărtează supranatantul fără a deranja extractul concentrat. 1.1.5. Se face o nouă suspensie a extractului concentrat în 1,5 ml tampon concentrat (apendicele 4). Se folosesc 500 μl pentru a testa R. solanacearum, 500 μl pentru Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus și 500 μl pentru referință. Se adaugă glicerol steril la concentrația finală de 10-25 % (volum) la 500 μl de alicote de
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
efectuează o dezinfectare scurtă a bucăților cu etanol de 70 % și se usucă de îndată cu ajutorul hârtiei absorbante. Apoi, se prelucrează bucățile de tulpină în conformitate cu una dintre următoarele proceduri: (a) se acoperă cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extracție (apendicele 4) și se introduc într-un agitator rotativ (50-100 turații/minut) timp de patru ore la o temperatură mai mică de 24 °C sau la o temperatură de refrigerare timp de 16-24 ore sau (b) bucățile se
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
o temperatură mai mică de 24 °C sau la o temperatură de refrigerare timp de 16-24 ore sau (b) bucățile se zdrobesc de îndată într-un sac de macerare rezistent (de exemplu, Stomacher sau Bioreba) cu un volum corespunzător de tampon de extracție (apendicele 4) cu ajutorul unui ciocan de cauciuc sau al unui dispozitiv de măcinare corespunzător (de exemplu, Homex). În cazul în care acest lucru nu este posibil, bucățile se păstrează, fără a depăși 72 ore la temperatură de refrigerare
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
la 10 000 g timp de zece minute (sau la 7 000 g timp de 15 minute), preferabil la o temperatură de 4-10 °C, se îndepărtează supranatantul și se face o nouă suspensie a extractului concentrat în 1 ml de tampon concentrat (apendicele 4). (b) Filtrare pe membrană (dimensiunea minimă a porilor de 0,45 μm) urmată de spălarea filtrului în 5-10 ml de tampon concentrat și reținerea soluțiilor de spălare. Această metodă este potrivită pentru volume mari de apă cu
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
se îndepărtează supranatantul și se face o nouă suspensie a extractului concentrat în 1 ml de tampon concentrat (apendicele 4). (b) Filtrare pe membrană (dimensiunea minimă a porilor de 0,45 μm) urmată de spălarea filtrului în 5-10 ml de tampon concentrat și reținerea soluțiilor de spălare. Această metodă este potrivită pentru volume mari de apă cu conținut mic de saprofite. În general, concentrarea nu se recomandă pentru eșantioanele de efluenți proveniți din prelucrarea cartofilor sau de efluenți de ape reziduale
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
care reprezintă volumul total de nămol de testat. Se amestecă bine fiecare eșantion înainte de testare. 2.1.2. Se împart eșantioanele în subeșantioane de 10-25 g de sol sau de nămol cu ajutorul unui agitator rotativ (250 turații/minut) într-un tampon de extracție de 60-150 ml (apendicele 4) timp de două ore cel mult. După caz, pentru a favoriza dispersia, se adaugă 0,02 % de Tween 20 steril și 10-20 g de pietriș steril. 2.1.3. Suspensia se păstrează, în timpul
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
cu extracte de eșantion proaspăt preparate. După caz, se pot folosi și extracte conservate în soluție de glicerol la o temperatură cuprinsă între - 68 °C și - 86 °C. Glicerolul poate fi separat de eșantion prin adăugarea a 1 ml de tampon concentrat (a se vedea apendicele 4), recentrifugarea timp de cincisprezece minute la 7 000 g și resuspendarea în același volum de tampon concentrat. Acest lucru este rareori necesar, mai ales atunci când eșantioanele sunt fixate de lame prin flambare. Se prepară
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
între - 68 °C și - 86 °C. Glicerolul poate fi separat de eșantion prin adăugarea a 1 ml de tampon concentrat (a se vedea apendicele 4), recentrifugarea timp de cincisprezece minute la 7 000 g și resuspendarea în același volum de tampon concentrat. Acest lucru este rareori necesar, mai ales atunci când eșantioanele sunt fixate de lame prin flambare. Se prepară lame de control pozitiv separate dintr-o sușă omologă sau orice altă sușă de referință de R. solanacearum în suspensie în extract
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
sunt fixate de lame prin flambare. Se prepară lame de control pozitiv separate dintr-o sușă omologă sau orice altă sușă de referință de R. solanacearum în suspensie în extract de cartof, după cum prevede apendicele 3 B și, facultativ, în tampon. În cazul în care este posibil, ar trebui să se folosească drept control similar pe aceeași lamă țesut infectat în mod natural (conservat prin liofilizare sau congelare la o temperatură între - 16 și - 24 °C). În calitate de control negativ, se pot
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
primul șir. Al doilea șir poate fi folosit ca duplicat sau pentru un al doilea eșantion, în conformitate cu cele indicate în figura 1. (ii) Pentru alte extracte concentrate: Se pregătesc diluții zecimale (1/10, 1/100) din extractul concentrat resuspendat în tamponul de concentrare. Se pipetează un volum standard (15 μl corespund unei ferestre de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru ferestre cu un diametru mai mare) din extractul concentrat resuspendat și din fiecare diluție într-un șir de ferestre. Șirul
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T). (ii) În conformitate cu metoda de pregătire a lamelor de test indicată la punctul 5.1 (ii): Se prepară diluția de lucru a anticorpilor în tampon pentru imunofluorescență. Diluția de lucru are efect asupra specificității. Figura 1: Pregătirea lamei de test în conformitate cu punctele 5.1. (i) și 5.3. (i) Diluții ale extractului concentrat resuspendat 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 Diluții
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
anticorpi: 5.3.2. Se incubează lamele pe hârtie umedă acoperite timp de 30 de minute la temperatura ambiantă (18-25 °C). 5.3.3. Se scutură picăturile de antiser de pe fiecare lamă și se clătesc lamele cu atenție cu un tampon pentru imunofluorescență. Se spală timp de cinci minute în soluție tampon IF-Tween (apendicele 4) și apoi în tampon IF. Se evită orice vaporizare sau scurgere care ar putea conduce la o contaminare încrucișată. Excesul de umezeală se îndepărtează cu grijă
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
timp de 30 de minute la temperatura ambiantă (18-25 °C). 5.3.3. Se scutură picăturile de antiser de pe fiecare lamă și se clătesc lamele cu atenție cu un tampon pentru imunofluorescență. Se spală timp de cinci minute în soluție tampon IF-Tween (apendicele 4) și apoi în tampon IF. Se evită orice vaporizare sau scurgere care ar putea conduce la o contaminare încrucișată. Excesul de umezeală se îndepărtează cu grijă cu o sugativă. 5.3.4. Se așază lamele pe hârtie
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
ambiantă (18-25 °C). 5.3.3. Se scutură picăturile de antiser de pe fiecare lamă și se clătesc lamele cu atenție cu un tampon pentru imunofluorescență. Se spală timp de cinci minute în soluție tampon IF-Tween (apendicele 4) și apoi în tampon IF. Se evită orice vaporizare sau scurgere care ar putea conduce la o contaminare încrucișată. Excesul de umezeală se îndepărtează cu grijă cu o sugativă. 5.3.4. Se așază lamele pe hârtie umedă. Se acoperă ferestrele de test cu
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
anticorpi. Celulele cu colorație incompletă sau cu fluorescență slabă nu trebuie luate în considerare. În cazul în care se suspectează o contaminare, testul trebuie refăcut. Se poate întâmpla atunci când toate lamele unui lot indică celule pozitive din cauza unei contaminări a tamponului sau atunci când celulele pozitive sunt izolate (în afara ferestrelor) la mijlocul lamei. 5.4.3. Există un anumit număr de chestiuni inerente specificității testului de imunofluorescență. Pot apărea populații de celule fluorescente atipice din punct de vedere morfologic și bacterii saprofite care
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
trebui tratate întotdeauna ca eșantioane finale în procedură, pentru a indica o eventuală apariție a unui transfer de ADN. Următoarele controale negative ar trebui incluse în testul PCR: - Extractul eșantionului care a produs anterior rezultate negative pentru depistarea R. solanacearum; - Tampoanele de control utilizate pentru a extrage bacteria și ADN din eșantion; - Amestecul reactiv pentru PCR. Următoarele controale pozitive ar trebui incluse: - Alicote ale extractelor concentrate resuspendate la care s-a adăugat R. solanacearum (preparare: a se vedea apendicele 3 B
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
inhibitorilor PCR și a altor reacții enzimatice și concentrează ADN țintă în extractul de eșantion. Următoarea metodă a fost optimizată pentru utilizare în cadrul metodelor PCR validate indicate în apendicele 6. (a) Metoda Pastrik (2000) (1) Se pipetează 220 μl de tampon de liză [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] într-un tub Eppendorf de 1,5 ml. (2) Se adaugă 100 μl de extract de eșantion și se introduce într-un bloc
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
3.1. Fragmentele PCR se detectează prin electroforeză în gel de agar. Se pune sub tensiune la 5-8 V/cm o cantitate de cel puțin 12 μl de amestec reactiv de ADN amplificat din fiecare eșantion împreună cu 3 μl de tampon de lest (apendicele 6) pe un mediu agarizat la 2,0 % într-un tampon tri-acetat-EDTA (ETA) (apendicele 6). Se folosește un marcator de ADN corespunzător, precum "100 bp ladder". 6.3.2. Pentru vizualizarea fragmentelor de ADN, se recurge la
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
sub tensiune la 5-8 V/cm o cantitate de cel puțin 12 μl de amestec reactiv de ADN amplificat din fiecare eșantion împreună cu 3 μl de tampon de lest (apendicele 6) pe un mediu agarizat la 2,0 % într-un tampon tri-acetat-EDTA (ETA) (apendicele 6). Se folosește un marcator de ADN corespunzător, precum "100 bp ladder". 6.3.2. Pentru vizualizarea fragmentelor de ADN, se recurge la colorare cu bromură de etidiu (la 0,5 mg/l) timp de 30-60 de
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
noile cazuri sau constatări, se verifică autenticitatea fragmentului amplificat PCR efectuând o analiză enzimatică restrictivă pe un eșantion al ADN amplificat rămas. În acest scop, se incubează la o temperatură optimă pe o durată optimă folosind o enzimă și un tampon corespunzător (a se vedea apendicele 6). Fragmentele digerate prin electroforeză în gel de agar se detectează în conformitate cu metoda descrisă anterior și se vizualizează prin iluminare ultravioletă dispunerea tipică a fragmentelor după analiza enzimatică restrictivă și colorarea cu bromură de etidiu
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
de identificare a R. solanacearum. Drept eșantioane de control pozitiv, se prepară suspensii conținând 105-106 de celule pe ml de biovar 2 R. solanacearum (de exemplu, sușa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; a se vedea apendicele 3) într-un tampon fosfat 0,01 M (PB), dintr-o cultură de 3-5 zile. Se prepară lame separate de control pozitiv din sușa omologă sau din orice altă sușă de referință de R. solanacearum, în suspensie în extract de cartof, în conformitate cu apendicele 3
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
1.5. Se picură 16 μl din suspensiile fixate pe o lamă multitest curată, în conformitate cu figura 7.1. Pe fiecare lamă se aplică două eșantioane diferite, nediluate, și se folosesc 10 μl pentru o diluție de 1:100 (într-un tampon fosfat 0,01 M). Restul soluției de eșantion (49 μl) poate fi conservată la - 20 °C după ce i s-a adăugat un volum de etanol de 96 %. În cazul în care testul FISH trebuie repetat, se elimină etanolul prin centrifugare
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
eșantion (49 μl) poate fi conservată la - 20 °C după ce i s-a adăugat un volum de etanol de 96 %. În cazul în care testul FISH trebuie repetat, se elimină etanolul prin centrifugare și se adaugă un volum echivalent de tampon fosfat 0,01 M (se amestecă în agitator). Figura 7.1. Configurația unei lame pentru testul FISH ***[PLEASE INSERT FIGURE AND REPLACE TEXT WITH THE ROMANIAN CORRESPONDENT]*** Échant. 1 = eșant. 1 Fenêtre 1 = fereastra 1 Témoin = control Fenêtre 2 = fereastra
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]