50 matches
-
nu are întotdeauna drept rezultat apariția unui ECP. În consecință, fiecare cupulă este supusă unui test de hemadsorbție precum cel descris anterior sau unui test IF (vezi partea III.6.1). III.4.1. Din mijlocul culturii celulare din fiecare cupulă, inclusiv din cupulele martorilor pozitivi și negativi, se efectuează o prelevare și fiecare prelevare se introduce într-un tub steril etichetat. La fiecare cupulă se adaugă 500 μl de suspensie 0,2 % (v/v) de globule roșii de iepure sau
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
drept rezultat apariția unui ECP. În consecință, fiecare cupulă este supusă unui test de hemadsorbție precum cel descris anterior sau unui test IF (vezi partea III.6.1). III.4.1. Din mijlocul culturii celulare din fiecare cupulă, inclusiv din cupulele martorilor pozitivi și negativi, se efectuează o prelevare și fiecare prelevare se introduce într-un tub steril etichetat. La fiecare cupulă se adaugă 500 μl de suspensie 0,2 % (v/v) de globule roșii de iepure sau de cal spălate
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
test IF (vezi partea III.6.1). III.4.1. Din mijlocul culturii celulare din fiecare cupulă, inclusiv din cupulele martorilor pozitivi și negativi, se efectuează o prelevare și fiecare prelevare se introduce într-un tub steril etichetat. La fiecare cupulă se adaugă 500 μl de suspensie 0,2 % (v/v) de globule roșii de iepure sau de cal spălate sau de suspensie de 0,005 % de globule roșii de păstrăv curcubeu sau de somon de Atlantic spălate și se lasă
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
de cal spălate sau de suspensie de 0,005 % de globule roșii de păstrăv curcubeu sau de somon de Atlantic spălate și se lasă să incubeze la temperatura ambiantă timp de 45 de minute. Se îndepărtează globulele roșii și fiecare cupulă este spălată de două ori într-un mediu L-15. Fiecare cupulă este examinată la microscop. III.4.2. Prezența grupelor de globule roșii aderente pe suprafața celulelor SHK-1 sau TO indică infecția presupusă cu un ortomixovirus. Dacă testul de
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
de păstrăv curcubeu sau de somon de Atlantic spălate și se lasă să incubeze la temperatura ambiantă timp de 45 de minute. Se îndepărtează globulele roșii și fiecare cupulă este spălată de două ori într-un mediu L-15. Fiecare cupulă este examinată la microscop. III.4.2. Prezența grupelor de globule roșii aderente pe suprafața celulelor SHK-1 sau TO indică infecția presupusă cu un ortomixovirus. Dacă testul de hemadsorbție este pozitiv, se efectuează imediat un test de identificare a virusului
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
pozitiv, se efectuează imediat un test de identificare a virusului (III.6). III.5. Subcultura sau trecerea III.5.1. Între a treisprezecea și a cincisprezecea zi se realizează o subcultură. Se adaugă 225 μl de suspensie de cultură în cupulele care conțin celule SHK-1 în fază activă de creștere pe lame cu douăsprezece cupule, apoi se lasă să incubeze la 14 ± 2 șC timp de cel mult optsprezece zile. Celulele de cultură se examinează de două ori la microscop pentru
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
Subcultura sau trecerea III.5.1. Între a treisprezecea și a cincisprezecea zi se realizează o subcultură. Se adaugă 225 μl de suspensie de cultură în cupulele care conțin celule SHK-1 în fază activă de creștere pe lame cu douăsprezece cupule, apoi se lasă să incubeze la 14 ± 2 șC timp de cel mult optsprezece zile. Celulele de cultură se examinează de două ori la microscop pentru căutarea unui ECP, mai întâi între a cincea și a șaptea zi, apoi între
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
într-un mediu L-15 care conține 5 % ser de fetus bovin, 2 % (v/v) de L-glutamină la 200 mM și 0,08 % (v/v) de 2-mercaptoetanol la 50 mM pe lame cu douăzeci și patru sau nouăzeci și șase de cupule, cu o densitate care creează o confluență mai mare de 50 %. Se pot utiliza și alte descendențe celulare sau un mediu de cultură cu o eficacitate confirmată. Se adaugă 225 μl de suspensie de cultură presupusă a fi infectată de
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
confluență mai mare de 50 %. Se pot utiliza și alte descendențe celulare sau un mediu de cultură cu o eficacitate confirmată. Se adaugă 225 μl de suspensie de cultură presupusă a fi infectată de virus, la fiecare din cele două cupule, se amestecă și se transferă 225 μl în alte două cupule, la o diluție de 1:5. Alte două cupule neinoculate servesc drept martori. Eșantioanele diferitelor exploatații se tratează pe lame separate, la fel ca și martorii. Virusul este controlat
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
celulare sau un mediu de cultură cu o eficacitate confirmată. Se adaugă 225 μl de suspensie de cultură presupusă a fi infectată de virus, la fiecare din cele două cupule, se amestecă și se transferă 225 μl în alte două cupule, la o diluție de 1:5. Alte două cupule neinoculate servesc drept martori. Eșantioanele diferitelor exploatații se tratează pe lame separate, la fel ca și martorii. Virusul este controlat pe un izolat de referință al virusului AIS. III.6.1
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
confirmată. Se adaugă 225 μl de suspensie de cultură presupusă a fi infectată de virus, la fiecare din cele două cupule, se amestecă și se transferă 225 μl în alte două cupule, la o diluție de 1:5. Alte două cupule neinoculate servesc drept martori. Eșantioanele diferitelor exploatații se tratează pe lame separate, la fel ca și martorii. Virusul este controlat pe un izolat de referință al virusului AIS. III.6.1.2. Lamele se incubează la 14 ± 2 șC și
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
la 14 ± 2 șC și sunt examinate la microscop timp de cel mult șapte zile. Dacă se observă un ECP precoce sau dacă nu se observă nici un ECP în termen de șapte zile, etapa următoare este fixarea. În acest scop, cupulele se spală cu PBS și se fixează prin incubare cu 80 % acetonă, timp de 20 de minute, la temperatura ambiantă. Lamele sunt lăsate să se usuce în aer și apoi sunt colorate imediat sau sunt stocate la o temperatură de
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
ambiantă. Lamele sunt lăsate să se usuce în aer și apoi sunt colorate imediat sau sunt stocate la o temperatură de 0-6 șC timp de cel mult 24 de ore înainte de colorare. III.6.1.3. Se marchează dubluri de cupule cu anticorpul monoclonal antivirus AIS 3H6F8 sau cu un alt anticorp monoclonal cu o eficacitate și specificitate confirmate, se diluează în PBS și se lasă la incubat, la o temperatură de 37 ± 4 șC, timp de 30 de minute. Se
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
37 ± 4 șC, timp de 30 de minute. Se îndepărtează anticorpul monoclonal și se spală lamele de trei ori cu 0,05 % Tween 20 în PBS. Se adaugă un conjugat anti-IgG de șoarece marcat FITC, diluat în PBS în fiecare cupulă și se incubează la 37 ± 4 șC, timp de 30 de minute. De notat: diluțiile diferitelor loturi de anticorp monoclonal și conjugat FITC se optimizează în fiecare laborator. Se îndepărtează anticorpul și se spală lamele de trei ori cu 0
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
notat: diluțiile diferitelor loturi de anticorp monoclonal și conjugat FITC se optimizează în fiecare laborator. Se îndepărtează anticorpul și se spală lamele de trei ori cu 0,05 % de Tween 20 în PBS. III.6.1.4. Se examinează imediat cupulele la un microscop inversat, echipat pentru fluorescență cu un filtru adaptat pentru excitarea FITC. Un test este considerat pozitiv dacă se observă celule fluorescente. Pentru ca un test să fie valabil, martorii pozitivi trebuie să indice un rezultat pozitiv, iar martorii
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
cu sonde ADN sau unei secvențieri. IV.1.4. Confirmarea prin PCR a virusului AIS izolat într-o cultură tisulară Dacă în cursul examenului virologic al eșantioanelor de țesut din celulele SHK-1 se produce un efect citopatic (ECP) complet, din cupulă se scot 400 µl de suspensie, care sunt turnați într-un tub steril de 1,5 ml. Din eșantionul respectiv se extrage ARN-ul, după cum se indică la partea III.1 și se efectuează testul RT-PCR. În cazul utilizării unor
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
ml. Din eșantionul respectiv se extrage ARN-ul, după cum se indică la partea III.1 și se efectuează testul RT-PCR. În cazul utilizării unor culturi în care ECP nu este complet, se îndepărtează suspensia, se recuperează celulele prin răzuirea suprafeței cupulei sau a flaconului, care apoi se introduc într-un tub steril de 1,5 ml, în scopul extragerii ARN și efectuării testului RT-PCR. IV.1.5. Confirmarea produselor PCR prin sondă ADN a) Specificitatea unui produs PCR de 155 pb
jrc5932as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/91104_a_91891]
-
I III 1). Raportul dintre dimensiunea inoculatului și volumul mediului de cultură celulară trebuie să fie de aproximativ 1:10. Pentru fiecare diluție și fiecare cultură celulară, trebuie să se utilizeze cel puțin 2 cm² de celule, ceea ce corespunde unei cupule într-o placă celulară cu 24 de cupule. Se recomandă utilizarea plăcilor de cultură celulară, dar se admit și alte suporturi care prezintă o suprafață de creștere similară sau superioară. 3. Incubarea culturilor celulare Se incubează culturile celulare inoculate la
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
volumul mediului de cultură celulară trebuie să fie de aproximativ 1:10. Pentru fiecare diluție și fiecare cultură celulară, trebuie să se utilizeze cel puțin 2 cm² de celule, ceea ce corespunde unei cupule într-o placă celulară cu 24 de cupule. Se recomandă utilizarea plăcilor de cultură celulară, dar se admit și alte suporturi care prezintă o suprafață de creștere similară sau superioară. 3. Incubarea culturilor celulare Se incubează culturile celulare inoculate la 15°C timp de șapte până la zece zile
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
după o primă incubație de șapte până la zece zile, se procedează la o sub-cultură cu culturile celulare proaspete folosindu-se o suprafață celulară similară cu cea a culturii primare. Părți alicote din mediu (lichid de suprafață) provenind de la toate culturile/cupulele care constituie cultura primară se reunesc, în funcție de cultura de celule, la șapte sau zece zile de la inoculare. Amestecurile respective sunt apoi inoculate în culturile celulare omoloage, nediluate și diluate la 1:10 (dând diluții finale ale lichidului de suprafață de
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
1:10 (dând diluții finale ale lichidului de suprafață de respectiv 1:10 și 1:100), după descrierea din partea I III 2. Se pot de asemenea inocula părți alicote de 10% din mediul care constituie cultura primară direct într-o cupulă cu culturi celulare proaspete (sub-culturi de cupulă la cupulă). Inocularea poate fi precedată de o preincubare a diluțiilor cu antiser împotriva virusului NPI la o diluție corespunzătoare, după descrierea din partea I II 3. Se incubează apoi culturile inoculate timp de
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
de suprafață de respectiv 1:10 și 1:100), după descrierea din partea I III 2. Se pot de asemenea inocula părți alicote de 10% din mediul care constituie cultura primară direct într-o cupulă cu culturi celulare proaspete (sub-culturi de cupulă la cupulă). Inocularea poate fi precedată de o preincubare a diluțiilor cu antiser împotriva virusului NPI la o diluție corespunzătoare, după descrierea din partea I II 3. Se incubează apoi culturile inoculate timp de șapte până la zece zile la 15°C
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
de respectiv 1:10 și 1:100), după descrierea din partea I III 2. Se pot de asemenea inocula părți alicote de 10% din mediul care constituie cultura primară direct într-o cupulă cu culturi celulare proaspete (sub-culturi de cupulă la cupulă). Inocularea poate fi precedată de o preincubare a diluțiilor cu antiser împotriva virusului NPI la o diluție corespunzătoare, după descrierea din partea I II 3. Se incubează apoi culturile inoculate timp de șapte până la zece zile la 15°C, ținându-se
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
3. Tehnica IF descrisă mai sus este indicată cu valoare de exemplu. Se pot aplica și alte tehnici IF (cu privire la culturile celulare, la fixare și anticorpii de referință de calitate) dacă s-a dovedit eficacitatea acestora. 4. ELISA Se acoperă cupulele din plăcile de microtitrare timp de o noapte cu diluțiile recomandate din fracțiuni de imunoglobuline purificate provenind din seruri de referință de calitate. Se clătesc cupulele cu un tampon PBS-Tween-20, se adaugă virusul ce urmează să fie identificat, diluat din
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
de referință de calitate) dacă s-a dovedit eficacitatea acestora. 4. ELISA Se acoperă cupulele din plăcile de microtitrare timp de o noapte cu diluțiile recomandate din fracțiuni de imunoglobuline purificate provenind din seruri de referință de calitate. Se clătesc cupulele cu un tampon PBS-Tween-20, se adaugă virusul ce urmează să fie identificat, diluat din doi în doi sau din patru în patru, și se lasă să reacționeze cu anticorpul captator timp de 60 de minute la 37°C. După clătirea
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]