54,545 matches
-
ADN, aceasta din urmă poate fi inhibată, de exemplu, prin utilizarea unui mediu sărac în arginină, cu conținut scăzut în ser sau prin adăugare de hidroxiuree în mediul de cultură. Măsurarea USD prin LSC: Înainte de începerea tratamentului cu substanța de testare, se blochează intrarea celulelor în faza S în modul descris mai sus. Ulterior, celulele se tratează cu substanța de testare în conformitate cu descrierea pentru autoradiografie. La sfârșitul perioadei de incubație, ADN este extras din celule și se determină conținutul total de
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
ser sau prin adăugare de hidroxiuree în mediul de cultură. Măsurarea USD prin LSC: Înainte de începerea tratamentului cu substanța de testare, se blochează intrarea celulelor în faza S în modul descris mai sus. Ulterior, celulele se tratează cu substanța de testare în conformitate cu descrierea pentru autoradiografie. La sfârșitul perioadei de incubație, ADN este extras din celule și se determină conținutul total de ADN și proporția de 3H-TdR încorporată. Trebuie menționat faptul că dacă în tehnicile descrise mai sus se utilizează limfocite umane
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
3H-TdR încorporată în citoplasmă se determină prin numărarea a trei arii de mărimea nucleului, din citoplasma fiecărei celule numărate. Determinările LSC Pentru determinarea prin LSC a USD, se utilizează un număr adecvat de culturi pentru fiecare concentrație a substanței de testare și pentur martori. Toate rezultatele trebuie confirmate într-un experiment independent. 2. DATE Datele sunt prezentate sub formă de tabele. 2.1. Determinările autoradiografice Cantitatea de 3H-TdR încorporată în citoplasmă și numărul de granulații găsite în nucleii celulari trebuie să
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
de test Protocolul trebuie să conțină, dacă este posibil, informațiile următoare: - celulele folosite, densitatea și numărul de pasaje celulare în momentul tratamentului, numărul de culturi celulare, - metodele folosite pentru menținerea culturilor, inclusiv compoziția mediului, temperatura și concentrația CO2, - substanța de testare, excipientul folosit, concentrațiile și motivația alegerii acestor concentrații folosite în experiment, - informații despre sistemul de activare metabolică, - schema de tratament, - martorii pozitivi și negativi, - tehnica de autoradiografie folosită, - metodele folosite pentru a bloca intrarea celulelor în faza S, - metodele folosite
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
partea B. TEST IN VITRO DE SCHIMBARE A CROMATIDELOR SURORI (SCE) 1. METODĂ 1.1 Introducere Vezi introducerea generală: partea B. 1.2. Definiție Vezi introducerea generală: partea B. 1.3. Substanțe de referință Nici una. 1.4. Principiul metodei de testare SCE este un test de scurtă durată de detectare a schimburilor reciproce de ADN între 2 cromatide surori ale unui cromozom în timpul duplicării. SCE reprezintă schimburile reciproce dintre produsele de replicare a ADN la locusuri aparent omologe. Se presupune că
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
sunt limitate. Detectarea SCE necesită câteva mijloace de marcare diferențiată a cromatidelor surori, rezultat ce poate fi obținut prin încorporarea bromodeoxiuridinei (BrdU) în ADN-ul cromozomial pentru două cicluri celulare. Celulele de mamifere sunt tratate in vitro cu substanța de testare cu și fără un sistem exogen de activare metabolică la mamifere, dacă este cazul, apoi sunt cultivate pe o perioadă de două cicluri de replicare într-un mediu ce conține BrdU. După tratarea cu un inhibitor de fus mitotic (de
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
tratarea cu un inhibitor de fus mitotic (de exemplu colchicină) pentru oprirea celulelor în stadiul de metafază al mitozei (c-metafaza), celulele sunt prelevate și se efectuează preparatele cromozomiale. 1.5. Criterii de calitate Nici unul. 1.6. Descrierea metodei de testare Pregătire Pentru acest test se pot folosi culturi celulare primare (limfocite umane) sau linii celulare bine caracterizate (de exemplu, celule ovariene de hamster chinezesc). Liniile celulare trebuie verificate pentru a decela contaminarea cu Mycoplasma. * Trebuie folosite medii de cultură și
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
tratamentului celulelor. Concentrația finală de excipient în mediul de cultură nu trebuie să afecteze în mod semnificativ viabilitatea celulară sau rata de creștere, iar efectele asupra frecvenței SCE trebuie monitorizate printr-un solvent martor. Celulele se tratează cu substanța de testare atât în prezența cât și în absența unui sistem exogen adecvat de activare metabolică la mamifere. Alternativ, dacă se folosesc celule cu activitate metabolică intrinsecă, trebuie să se cunoască intensitatea și natura acestei activități, astfel încât să fie corespunzătoare clasei de
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
un martor pentru excipient. Exemple de substanțe ce pot fi folosite ca martori pozitivi: - compuși cu activare directă: - etilmetansulfonatul, - compuși cu activare indirectă: - ciclofosfamida. După caz, se poate introduce un martor pozitiv suplimentar din aceeași clasă chimică cu substanța de testare. Concentrații de expunere Se vor folosi cel puțin trei concentrații ale substanței de testare, spațiate în mod adecvat. Concentrația maximă trebuie să producă un efect toxic semnificativ, permițând totuși producerea unei replicări celulare corespunzătoare. Substanțele relativ insolubile în apă trebuie
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
compuși cu activare directă: - etilmetansulfonatul, - compuși cu activare indirectă: - ciclofosfamida. După caz, se poate introduce un martor pozitiv suplimentar din aceeași clasă chimică cu substanța de testare. Concentrații de expunere Se vor folosi cel puțin trei concentrații ale substanței de testare, spațiate în mod adecvat. Concentrația maximă trebuie să producă un efect toxic semnificativ, permițând totuși producerea unei replicări celulare corespunzătoare. Substanțele relativ insolubile în apă trebuie testate până la limita superioară a solubilității prin metode adecvate. Pentru substanțele netoxice foarte ușor
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
alternativă, se pot folosi suspensiile de culturi celulare. Culturile de limfocite umane se pot obține din sânge heparinizat, prin tehnici adecvate și sunt incubate la 37 C. Tratament Celulele aflate în stadiul de creștere exponențială se tratează cu substanța de testare pe o perioadă de timp corespunzătoare, în majoritatea cazurilor fiind suficiente una sau două ore. Durata tratamentului poate fi extinsă în anumite cazuri până la două cicluri celulare complete. Celulele fără o activitate metabolică intrinsecă corespunzătoare se tratează cu substanța de
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
pe o perioadă de timp corespunzătoare, în majoritatea cazurilor fiind suficiente una sau două ore. Durata tratamentului poate fi extinsă în anumite cazuri până la două cicluri celulare complete. Celulele fără o activitate metabolică intrinsecă corespunzătoare se tratează cu substanța de testare atât în prezența cât și în absența unui sistem de activare metabolică. La sfârșitul perioadei de expunere, celulele se spală abundent pentru îndepărtarea substanței de testare și se cultivă timp de două cicluri de replicare în prezența BrdU. Ca tehnică
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
celulare complete. Celulele fără o activitate metabolică intrinsecă corespunzătoare se tratează cu substanța de testare atât în prezența cât și în absența unui sistem de activare metabolică. La sfârșitul perioadei de expunere, celulele se spală abundent pentru îndepărtarea substanței de testare și se cultivă timp de două cicluri de replicare în prezența BrdU. Ca tehnică alternativă, celulele pot fi tratate simultan cu substanța de testare și BrdU pentru întreaga perioadă de cultură de două cicluri celulare. Culturile de limfocite umane trebuie
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
de activare metabolică. La sfârșitul perioadei de expunere, celulele se spală abundent pentru îndepărtarea substanței de testare și se cultivă timp de două cicluri de replicare în prezența BrdU. Ca tehnică alternativă, celulele pot fi tratate simultan cu substanța de testare și BrdU pentru întreaga perioadă de cultură de două cicluri celulare. Culturile de limfocite umane trebuie tratate când sunt într-o stare semisincronă. Celulele trebuie analizate în perioada celei de-a doua diviziuni post-tratament, asigurând astfel expunerea la substanța chimică
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
prin metode statistice adecvate. 3. RAPORT 3.1. Protocol de test Protocolul trebuie să conțină, dacă este posibil, informațiile următoare: - celulele folosite, metodele de întreținere a culturilor celulare, - condițiile de desfășurare a testului: compoziția mediului, concentrația CO2, concentrația substanței de testare, excipientul folosit, temperatura de incubare, durata tratamentului, inhibitorul fusului de diviziune celulară folosit, concentrația acestuia și timpul de tratament cu acesta, tipul de sistem folosit pentru activarea metabolică la mamifere, martorii pozitivi și negativi, - numărul de culturi la fiecare punct
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
B. TESTUL DE LETALITATE RECESIVĂ ÎN RAPORT CU SEXUL LA DROSOPHILA MELANOGASTER (SLRL) 1. METODĂ 1.1. Introducere Vezi introducerea generală: partea B. 1.2. Definiție Vezi introducerea generală: partea B. 1.3. Substanțe de referință Nici una. 1.4. Principiul metodei de testare Testul SLRL pe Drosophila melanogaster este un test care depistează incidența mutațiilor, atât a mutațiilor punctiforme, cât și a delețiilor mici, în liniile germinative ale insectelor. Acest test este un test de mutații directe, prin care pot decela mutațiile în
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
unei generații de descendenți de sex masculin, din cele două care sunt normal produse de o femelă heterozigotă. Aceste determinări se fac prin intermediul unor cromozomi special marcați și dispuși. 1.5. Criterii de calitate Nici unul. 1. 6. Descrierea metodei de testare Pregătire Tulpini Pot fi folosiți masculi din tulpini sălbatice bine caracterizate și femele din tulpina Muller-5. De asemenea, se pot folosi femele din alte sușe marcate corespunzător, cu multiple inversiuni pe cromozomul X. Substanța de testare Substanțele trebuie dizolvate în
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
6. Descrierea metodei de testare Pregătire Tulpini Pot fi folosiți masculi din tulpini sălbatice bine caracterizate și femele din tulpina Muller-5. De asemenea, se pot folosi femele din alte sușe marcate corespunzător, cu multiple inversiuni pe cromozomul X. Substanța de testare Substanțele trebuie dizolvate în apă. Substanțele insolubile în apă pot fi dizolvate sau suspensionate într-un excipient adecvat (de exemplu, un amestec de etanol și Tween-60 sau 80), apoi diluate cu apă sau soluție salină înainte de administrare. Se recomandă evitarea
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
început, odată cu planificarea testului. Frecvența mutațiilor spontane observate la martorul corespunzător influențează puternic numărul de cromozomi tratați care trebuie analizați. Calea de administrare Expunerea se poate face pe cale orală, prin injectare sau expunere la gaze sau vapori. Administrarea substanței de testare prin hrană se poate face în soluții zaharoase. Dacă este necesar, substanța poate fi dizolvată într-o soluție de NaCl 0,7% și injectată în torace sau abdomen. Folosirea martorilor pozitivi și negativi În fiecare experiment trebuie folosiți martori negativi
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
de concentrație care produce câteva semne de toxicitate. Pentru substanțele netoxice se va face expunerea la concentrația maximă care poate fi obținută practic. Mod de operare Masculii din tulpinile sălbatice (în vârstă de trei-cinci zile) se tratează cu substanța de testare, apoi sunt împerecheați individual cu un număr în exces de femele virgine din tulpina Muller-S sau dintr-o altă tulpină marcată corespunzător (cu multiple inversiuni cromozomiale ale cromozomului X). La fiecare două - trei zile femelele trebuie înlocuite cu alte femele
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
partea B. TEST IN VITRO DE TRANSFORMARE A CELULELOR DE MAMIFERE 1. METODĂ 1.1. Introducere Vezi introducerea generală: partea B. 1.2. Definiție Vezi introducerea generală: partea B. 1.3. Substanțe de referință Nici una. 1.4. Principiul metodei de testare Pentru determinarea modificărilor fenotipice in vitro induse de substanțele chimice asociate cu transformări maligne in vivo, se folosesc sisteme de cultură de celule de mamifere. Cele mai des utilizate celule sunt C3H10T1/2, 3T3, SHE și celule de la șobolani Fisher
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
pe agar-agar semisolid. Există sisteme folosite mai rar care depistează alte modificări celulare morfologice sau fiziologice în urma expunerii la substanțe chimice cancerigene. Nici unul din mecanismele testate in vitro nu are o legătură definită și directă cu cancerul. Anumite sisteme de testare pot detecta promotori tumorali. Citotoxicitatea poate fi determinată prin măsurarea efectelor materialului testat asupra capacităților de formare de colonii (eficiența de clonare) sau asupra ratei de creștere a culturilor. Măsurarea citotoxicității are rolul de a stabili dacă expunerea la substanța
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
chimică testată are relevanță toxicologică, dar nu poate fi folosită pentru a calcula frecvența transformărilor în toate testele, deoarece unele dintre acestea pot necesita incubare prelungită și/sau recultivare. 1.5. Criterii de calitate Nici unul. 1.6. Descrierea metodei de testare Pregătire Celule În funcție de testul de transformare folosit, sunt disponibile diferite linii celulare sau celule primare. Cercetătorul trebuie să se asigure că celulele folosite în cadrul testului manifestă modificări fenotipice corespunzătoare după expunerea la un agent cancerigen cunoscut și că testul efectuat
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
în cadrul testului manifestă modificări fenotipice corespunzătoare după expunerea la un agent cancerigen cunoscut și că testul efectuat are o validitate și o fiabilitate demonstrate și documentate. Mediu Se utilizează medii și condiții experimentale corespunzătoare testului de transformare efectuat. Substanța de testare Substanțele testate pot fi preparată în mediile de cultură sau dizolvate ori suspensionate într-un excipient adecvat, înainte de tratarea celulelor. Concentrația finală a excipientului în sistem nu trebuie să afecteze viabilitatea celulară, rata de creștere sau incidența transformărilor. Activarea metabolică
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]
-
de cultură sau dizolvate ori suspensionate într-un excipient adecvat, înainte de tratarea celulelor. Concentrația finală a excipientului în sistem nu trebuie să afecteze viabilitatea celulară, rata de creștere sau incidența transformărilor. Activarea metabolică Celulele trebuie să tratate cu substanța de testare atât în prezența cât și în absența unui sistem adecvat de activare metabolică. Dacă tipul celular folosit are activitate metabolică intrinsecă, natura acestei activități trebuie să fie cunoscută și adecvată clasei de substanțe chimice testate. Condiții experimentale Folosirea martorilor pozitivi
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/86466_a_87253]