7,100 matches
-
trebuie să fie echivalent cu volumul extractului aplicat. 2.3.2. Se incubează acoperit timp de 30 de minute la temperatura camerei. 2.3.3. Se scutură picăturile de antiser de pe lamă și se clătesc lamele cu atenție cu un tampon IF. Se spală timp de cinci minute în soluție tampon IF - Tween și apoi cinci minute în tampon IF (apendicele 3). Excesul de umezeală se îndepărtează cu grijă. 2.3.4. Se aranjează lamele pe hârtie absorbantă. Se acoperă ferestrele
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
2. Se incubează acoperit timp de 30 de minute la temperatura camerei. 2.3.3. Se scutură picăturile de antiser de pe lamă și se clătesc lamele cu atenție cu un tampon IF. Se spală timp de cinci minute în soluție tampon IF - Tween și apoi cinci minute în tampon IF (apendicele 3). Excesul de umezeală se îndepărtează cu grijă. 2.3.4. Se aranjează lamele pe hârtie absorbantă. Se acoperă ferestrele de test și fereastra FITC cu diluția conjugatului FITC utilizat
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
minute la temperatura camerei. 2.3.3. Se scutură picăturile de antiser de pe lamă și se clătesc lamele cu atenție cu un tampon IF. Se spală timp de cinci minute în soluție tampon IF - Tween și apoi cinci minute în tampon IF (apendicele 3). Excesul de umezeală se îndepărtează cu grijă. 2.3.4. Se aranjează lamele pe hârtie absorbantă. Se acoperă ferestrele de test și fereastra FITC cu diluția conjugatului FITC utilizat pentru determinarea titrului. Volumul conjugatului aplicat în ferestre
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
de pe placa de microtitru. 3.1. Se pipetează 100 - 200 μl din extractul concentrat resuspendat într-o microfiolă. Se încălzește timp de 4 minute la 100 șC. Se pune microfiola la gheață. 3.2. Se adaugă un volum egal de tampon de acoperire din carbonat dublu concentrat (apendicele 5). Se centrifughează. 3.3. Se aplică 100 μl alicote fiecăreia dintre minim ultimele două puțuri ale plăcii de microtitrare. Se incubează o oră la 37 șC sau peste noapte la 4 șC.
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
4. Se scot extractele din puțuri. Se spală puțurile de trei ori cu PBS - Tween (apendicele 5), lăsând ultima soluție de spălare cel puțin cinci minute în puțuri. 3.5. Se prepară diluția corespunzătoare a antiserului de Ralstonia solanacearum în tampon de blocare (apendicele 5). Se aplică 100 μl de diluție de antiser în puțuri. Se incubează o oră la 37 șC. 3.6. Se scoate antiserul din puțuri. Se spală ca mai înainte (3.4). 3.7. Se prepară diluția
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
μl de diluție de antiser în puțuri. Se incubează o oră la 37 șC. 3.6. Se scoate antiserul din puțuri. Se spală ca mai înainte (3.4). 3.7. Se prepară diluția corespunzătoare de conjugat de fosfatază alcalină în tampon de blocare. Se aplică 100 μl de diluție conjugată în puțuri. Se incubează o oră la 37 șC. 3.8. Se scoate conjugatul din puțuri. Puțurile se spală ca mai înainte (3.4 și 3.6). 3.9. Se prepară
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
amestecul de reacție PCR (apendicele 6) într-o fiolă sterilă, prin adăugarea următoarelor componente în ordinea următoare: Pentru un volum de reacție de 50 μl: Component Cantitate Concentrație finală Apă distilată sterilă sau AUP 30,8 μl - 33,8 μl Tampon PCR × 10 5,0 μl 1× d-ATP 1,0 μl 0,2 mM d-CTP 1,0 μl 0,2 mM d-GTP 1,0 μl 0,2 mM d-TTP 1,0 μl 0,2 mM Amorsă OLI-
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
o durată mai mare. 4.6. Analiza produsului PCR Fragmentele PCR se detectează prin electroforeză în gel de agar și colorare cu bromură de etidiu. 4.6.1. Se prepară un mediu agarizat corespunzător aducând încet la fierbere agaroza în tampon de electroforeză tri-acetată (ETA). 4.6.2 Se răcește agaroza topită la 50 - 60 °C, se toarnă în cuva electroforezei și se introduce pieptenul. Soluția se lasă să se solidifice. 4.6.3 Se îndepărtează pieptenul. Gelul se introduce în
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
agaroza topită la 50 - 60 °C, se toarnă în cuva electroforezei și se introduce pieptenul. Soluția se lasă să se solidifice. 4.6.3 Se îndepărtează pieptenul. Gelul se introduce în ETA astfel încât să fie acoperit 2 - 3 mm de tampon. 4.6.4 Se pun 3 μl de picături de tampon de încărcare pe parafilm. Se adaugă 12 μl din produsul PCR din eșantion, din controlul pozitiv sau din controlul de apă și de amestecă prin aspirarea ușoară în conul
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
și se introduce pieptenul. Soluția se lasă să se solidifice. 4.6.3 Se îndepărtează pieptenul. Gelul se introduce în ETA astfel încât să fie acoperit 2 - 3 mm de tampon. 4.6.4 Se pun 3 μl de picături de tampon de încărcare pe parafilm. Se adaugă 12 μl din produsul PCR din eșantion, din controlul pozitiv sau din controlul de apă și de amestecă prin aspirarea ușoară în conul pipetei înainte de încărcare. Volumele date pot fi modificate pentru a corespunde
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
11. Autenticitatea fragmentului amplificat este confirmată prin analiza enzimatică restrictivă (REA). 4.7 Analiza enzimatică restrictivă (REA) 4.7.1. Se transferă 8,5 μl din produsul PCR (4.5.3) într-o altă microfiolă. Se adaugă 1 μl din tamponul enzimatic X10 și 0,5 μl din enzima de restricție Ava II. 4.7.2 Se amestecă prin aspirarea ușoară în conul pipetei. Dacă rămân picături pe pereții fiolei, se rotește pulsator într-o microcentrifugă. Se incubează o oră la
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
5.1 Testul se efectuează printr-o tehnică corespunzătoare de diluare galvano-plastică, cum ar fi: (i) Se prepară cel puțin două diluții zecimale, 1/10 și 1/100 sau mai multe, dacă se consideră util, din extractul concentrat resuspendat în tamponul de concentrare. Se pipetează un volum standard măsurat (50 - 100 μl) din extractul concentrat resuspendat și fiecare diluție într-un mediu selectiv SMSA modificat (apendicele 7) și se împrăștie cu o baghetă de sticlă pe toată suprafața mediului. Dacă se
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
unul sau mai multe alte locuri. 6.3 Prin aceeași tehnică se inoculează 10 răsaduri cu o suspensie de 106 celule pe ml dintr-o sușă virulentă din biovar 2 / rasa 3 de Ralstonia solanacearum drept control pozitiv și cu tampon de concentrare drept control negativ. Se separă plantele de control pozitiv de celelalte plante pentru a evita contaminarea încrucișată. 6.4 Plantele se cresc în continuare până la patru săptămâni la 22 C - 28 C și umiditate relativă mare, udându-le
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
verifică absența infecției în loturile de plante de test care nu prezintă semne de infecție. Din fiecare plantă de test se îndepărtează o secțiune de 1 cm de tulpină 2 cm deasupra punctului de inoculare. Se omogenizează țesuturile într-un tampon de macerare. Se efectuează o diluare galvao-plastică (secțiunea III.5.1) Dacă este pozitivă, se identifică culturile pure cu morfologie caracteristică (secțiunea II.4.1) și se confirmă culturile de Ralstonia solanacearum printr-un test de patogenicitate (secțiunea II.4
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
de 15 minute. Se răcește la 50 °C. Se adaugă o soluție apoasă sterilizată prin filtrare de clorurăr de trifeniltetrazoliu (Sigma) pentru obținerea concentrației finale de 50 mg la litru. Se toarnă pe plăci. Apendicele 2 Materiale pentru pregătirea eșantioanelor Tampon de macerare: 50 mM tampon fosfat, pH 7,0 Acest tampon este utilizat la macerarea țesuturilor. Na2HPO4 4,26 g KH2PO4 2,72 g Apă distilată 1 litru Se dizolvă ingredientele și se verifică pH-ul. Se divizează în părți
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
la 50 °C. Se adaugă o soluție apoasă sterilizată prin filtrare de clorurăr de trifeniltetrazoliu (Sigma) pentru obținerea concentrației finale de 50 mg la litru. Se toarnă pe plăci. Apendicele 2 Materiale pentru pregătirea eșantioanelor Tampon de macerare: 50 mM tampon fosfat, pH 7,0 Acest tampon este utilizat la macerarea țesuturilor. Na2HPO4 4,26 g KH2PO4 2,72 g Apă distilată 1 litru Se dizolvă ingredientele și se verifică pH-ul. Se divizează în părți alicote după cum se consideră necesar
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
soluție apoasă sterilizată prin filtrare de clorurăr de trifeniltetrazoliu (Sigma) pentru obținerea concentrației finale de 50 mg la litru. Se toarnă pe plăci. Apendicele 2 Materiale pentru pregătirea eșantioanelor Tampon de macerare: 50 mM tampon fosfat, pH 7,0 Acest tampon este utilizat la macerarea țesuturilor. Na2HPO4 4,26 g KH2PO4 2,72 g Apă distilată 1 litru Se dizolvă ingredientele și se verifică pH-ul. Se divizează în părți alicote după cum se consideră necesar. Se sterilizează prin autoclavizare la 121
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
Ultra Turrax pentru macerarea miezului de țesut de cartof. Fulgi de Lubrol 0,5 g la litru Silicon antispumant DC 1,0 ml la litru Pirofosfat tetrasodic 1,0 g la litru Se autoclavizează separat. Se adaugă până la concentrația dorită. Tampon de concentrare: 10 mM tampon fosfat, pH 7,2 Acest tampon este utilizat pentru resuspendarea și diluția talonului și extractelor concentrate de cartof. Na2HPO4·12H2O 2,7 g NaH2PO4·2H2O 0,4 g Apă distilată 1 litru Se dizolvă ingredientele
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
de țesut de cartof. Fulgi de Lubrol 0,5 g la litru Silicon antispumant DC 1,0 ml la litru Pirofosfat tetrasodic 1,0 g la litru Se autoclavizează separat. Se adaugă până la concentrația dorită. Tampon de concentrare: 10 mM tampon fosfat, pH 7,2 Acest tampon este utilizat pentru resuspendarea și diluția talonului și extractelor concentrate de cartof. Na2HPO4·12H2O 2,7 g NaH2PO4·2H2O 0,4 g Apă distilată 1 litru Se dizolvă ingredientele și se verifică pH-ul
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
Lubrol 0,5 g la litru Silicon antispumant DC 1,0 ml la litru Pirofosfat tetrasodic 1,0 g la litru Se autoclavizează separat. Se adaugă până la concentrația dorită. Tampon de concentrare: 10 mM tampon fosfat, pH 7,2 Acest tampon este utilizat pentru resuspendarea și diluția talonului și extractelor concentrate de cartof. Na2HPO4·12H2O 2,7 g NaH2PO4·2H2O 0,4 g Apă distilată 1 litru Se dizolvă ingredientele și se verifică pH-ul. Se divizează în părți alicote după cum
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
4 g Apă distilată 1 litru Se dizolvă ingredientele și se verifică pH-ul. Se divizează în părți alicote după cum se consideră necesar. Se sterilizează prin autoclavizare la 121°C timp de 15 minute. Apendicele 3 Materiale pentru testul IF Tampon IF: 10 mM salin tamponat fosfatic (PBS) pH 7,2 Acest tampon este utilizat pentru diluarea antiserurilor. Na2HPO4·12H2O 2,7 g NaH2PO4·2H2O 0,4 g NaCl 8,0 g Apă distilată 1 litru Se dizolvă ingredientele și se
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
pH-ul. Se divizează în părți alicote după cum se consideră necesar. Se sterilizează prin autoclavizare la 121°C timp de 15 minute. Apendicele 3 Materiale pentru testul IF Tampon IF: 10 mM salin tamponat fosfatic (PBS) pH 7,2 Acest tampon este utilizat pentru diluarea antiserurilor. Na2HPO4·12H2O 2,7 g NaH2PO4·2H2O 0,4 g NaCl 8,0 g Apă distilată 1 litru Se dizolvă ingredientele și se verifică pH-ul. Se divizează în părți alicote după cum se consideră necesar
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
2H2O 0,4 g NaCl 8,0 g Apă distilată 1 litru Se dizolvă ingredientele și se verifică pH-ul. Se divizează în părți alicote după cum se consideră necesar. Se sterilizează prin autoclavizare la 121 °C timp de 15 minute. Tampon IF-Tween Acest tampon este utilizat pentru spălarea lamelor. Se adaugă 0,1% Tween 20 la tamponul IF. 0,1 M glicerol tamponat fosfatic pH 7,6 Acest tampon este utilizat ca fluid de suport la ferestrele lamei IF pentru mărirea
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
g NaCl 8,0 g Apă distilată 1 litru Se dizolvă ingredientele și se verifică pH-ul. Se divizează în părți alicote după cum se consideră necesar. Se sterilizează prin autoclavizare la 121 °C timp de 15 minute. Tampon IF-Tween Acest tampon este utilizat pentru spălarea lamelor. Se adaugă 0,1% Tween 20 la tamponul IF. 0,1 M glicerol tamponat fosfatic pH 7,6 Acest tampon este utilizat ca fluid de suport la ferestrele lamei IF pentru mărirea fluorescenței. Na2HPO4.·12H2O
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
se verifică pH-ul. Se divizează în părți alicote după cum se consideră necesar. Se sterilizează prin autoclavizare la 121 °C timp de 15 minute. Tampon IF-Tween Acest tampon este utilizat pentru spălarea lamelor. Se adaugă 0,1% Tween 20 la tamponul IF. 0,1 M glicerol tamponat fosfatic pH 7,6 Acest tampon este utilizat ca fluid de suport la ferestrele lamei IF pentru mărirea fluorescenței. Na2HPO4.·12H2O 3,2 g NaH2PO4·2H2O 0,15 g Glicerol 50 ml Apă distilată
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]