1,689 matches
-
sistem de de-tecție legat la avidină, pattern-ul de hibridizare este utilizat pentru determinarea alelelor prezente. Această metodă este utilă în tiparea oricărui număr de probe, existând kit-uri comerciale pentru aplicarea ei. 12.1. APLICAREA ANALIZEI RFLP Dacă două alele diferă pentru o anumită secvență de nucleotide, fragmentul ADN amplificat poate fi testat pentru clivaj cu enzime de restricție specifice. Fragmentele ADN rezultate (restrictele) sunt analizate prin electroforeză în gel. Această abordare este disponibilă doar atunci când sunt prezente situsuri de
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
restrictele) sunt analizate prin electroforeză în gel. Această abordare este disponibilă doar atunci când sunt prezente situsuri de restricție cunoscute, pe când metoda PCR-RFLP se folosește ca o tehnică suplimentară pentru identificarea grosieră a tipurilor HLA. O altă metodă de identificare a alelelor HLA utilizează primeri cu specificitate de secvență (SSP) în cadrul reacției PCR numită, în acest caz, și metoda ARMS (de la Allele Refractory Mutation System) adică Sistemul Alelic Refractar la Mutație. Primerii se asociază la un subset de alele HLA cu secvențe
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
de identificare a alelelor HLA utilizează primeri cu specificitate de secvență (SSP) în cadrul reacției PCR numită, în acest caz, și metoda ARMS (de la Allele Refractory Mutation System) adică Sistemul Alelic Refractar la Mutație. Primerii se asociază la un subset de alele HLA cu secvențe complimentare la secvența primerilor (fig. 12.2). În cadrul reacții PCR ulterioare sunt amplificate doar aceste alele selectate în condiții strict controlate. ADN amplificat cu ajutorul unor asemenea primeri este identificat prin gel electroforeză și apoi pattern-ul de
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
și metoda ARMS (de la Allele Refractory Mutation System) adică Sistemul Alelic Refractar la Mutație. Primerii se asociază la un subset de alele HLA cu secvențe complimentare la secvența primerilor (fig. 12.2). În cadrul reacții PCR ulterioare sunt amplificate doar aceste alele selectate în condiții strict controlate. ADN amplificat cu ajutorul unor asemenea primeri este identificat prin gel electroforeză și apoi pattern-ul de amplificare este utilizat spre a determina tipurile de HLA. Procedura SSP este utilă în tiparea unui număr mic de
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
gel electroforeză și apoi pattern-ul de amplificare este utilizat spre a determina tipurile de HLA. Procedura SSP este utilă în tiparea unui număr mic de eșantioane, existând kit-uri comerciale pentru utilizarea ei. O altă metodă de identificare a alelelor HLA este reprezentată de secvențierea directă a ADN al alelelor HLA purtate de un individ uman. Secvențierea este laborioasă și foarte complexă, dar este cea mai precisă în identificarea corectă a perechii HLA potrivită pentru realizarea unui transplant. Aceasta deoarece
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
spre a determina tipurile de HLA. Procedura SSP este utilă în tiparea unui număr mic de eșantioane, existând kit-uri comerciale pentru utilizarea ei. O altă metodă de identificare a alelelor HLA este reprezentată de secvențierea directă a ADN al alelelor HLA purtate de un individ uman. Secvențierea este laborioasă și foarte complexă, dar este cea mai precisă în identificarea corectă a perechii HLA potrivită pentru realizarea unui transplant. Aceasta deoarece, secvențierea poate identifica toate diferențele prezente în regiunea analizată, pe când
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
interes, iar ADN amplificat este secvențiat direct, fără o clonare prealabilă a ADN într-un vector potrivit. Cum majoritatea persoanelor sunt heterozigote la locii HLA, se pot alege primeri cu specificitate de secvență, spre a se realiza amplificarea unei singure alele la un locus HLA testat. Există alternativa amplificării unui amestec de alele și de a le secvenția, utilizându-se analiza pozițiilor nucleotidice polimorfice, spre a identifica alelele prezente. Secvențiatoare automate de ADN facilitează achiziția și analiza datelor de secvențiere. Pentru
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
ADN într-un vector potrivit. Cum majoritatea persoanelor sunt heterozigote la locii HLA, se pot alege primeri cu specificitate de secvență, spre a se realiza amplificarea unei singure alele la un locus HLA testat. Există alternativa amplificării unui amestec de alele și de a le secvenția, utilizându-se analiza pozițiilor nucleotidice polimorfice, spre a identifica alelele prezente. Secvențiatoare automate de ADN facilitează achiziția și analiza datelor de secvențiere. Pentru stabilirea donorului potrivit unui anumit receptor se poate aplica și metoda analizei
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
alege primeri cu specificitate de secvență, spre a se realiza amplificarea unei singure alele la un locus HLA testat. Există alternativa amplificării unui amestec de alele și de a le secvenția, utilizându-se analiza pozițiilor nucleotidice polimorfice, spre a identifica alelele prezente. Secvențiatoare automate de ADN facilitează achiziția și analiza datelor de secvențiere. Pentru stabilirea donorului potrivit unui anumit receptor se poate aplica și metoda analizei polimorfismelor conformaționale cu specificitate de secvență sau a tipării heteroduplexului. În cadrul acestei metode, ADN amplificat
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
primitor sunt supuse procedurii de renaturare, după care se efectuează electroforeza. Monocatenele provenite de la un heterozigot renaturat A-A’ și a-a’ în care literele A și A’, respectiv a și a’ reprezintă catenele complementare ale ADN purtător al unei alele, respectiv al celeilalte alele, se vor asocia, spre a realiza homoduplexuri (A-A’ și respectiv a-a’) și heteroduplexuri (A-a’ și respectiv a-A’). Mobilitățile fragmentelor reasociate (dublu-catenare) vor fi variabile în funcție de secvența lor. Pe această cale se pot
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
de renaturare, după care se efectuează electroforeza. Monocatenele provenite de la un heterozigot renaturat A-A’ și a-a’ în care literele A și A’, respectiv a și a’ reprezintă catenele complementare ale ADN purtător al unei alele, respectiv al celeilalte alele, se vor asocia, spre a realiza homoduplexuri (A-A’ și respectiv a-a’) și heteroduplexuri (A-a’ și respectiv a-A’). Mobilitățile fragmentelor reasociate (dublu-catenare) vor fi variabile în funcție de secvența lor. Pe această cale se pot compara pattern-urile mobilităților
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
asocia, spre a realiza homoduplexuri (A-A’ și respectiv a-a’) și heteroduplexuri (A-a’ și respectiv a-A’). Mobilitățile fragmentelor reasociate (dublu-catenare) vor fi variabile în funcție de secvența lor. Pe această cale se pot compara pattern-urile mobilităților electroforetice ale alelelor donorului și receptorului, spre a se deduce dacă există potrivire alelică. Aceste pattern-uri electroforetice obținute fie pe calea SSCP, fie pe calea analizei heteroduplexului sunt complexe, dar totodată edificatoare asupra potrivirii alelelor HLA de la donor cu acelea de la receptor
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
pot compara pattern-urile mobilităților electroforetice ale alelelor donorului și receptorului, spre a se deduce dacă există potrivire alelică. Aceste pattern-uri electroforetice obținute fie pe calea SSCP, fie pe calea analizei heteroduplexului sunt complexe, dar totodată edificatoare asupra potrivirii alelelor HLA de la donor cu acelea de la receptor. Dar, identificarea în sine a alelelor specifice HLA existente la o anumită persoană este mult mai dificilă. Specificitatea tipajului HLA bazat pe analiza ADN este în mare măsură influențată de condițiile de reasociere
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
se deduce dacă există potrivire alelică. Aceste pattern-uri electroforetice obținute fie pe calea SSCP, fie pe calea analizei heteroduplexului sunt complexe, dar totodată edificatoare asupra potrivirii alelelor HLA de la donor cu acelea de la receptor. Dar, identificarea în sine a alelelor specifice HLA existente la o anumită persoană este mult mai dificilă. Specificitatea tipajului HLA bazat pe analiza ADN este în mare măsură influențată de condițiile de reasociere a primerilor sintetici și a probelor utilizate pentru reasociere cu ADN denaturat. În
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
sinteză din cadrul amplificării prin PCR și al secvențierii ADN, precum și la hibridizarea nespecifică a probelor (Gao și colab., 1990; Molkentin și colab., 1991; Allen și colab, 1994). Specificitatea poate fi însă monitorizată prin utilizarea unui ADN de referință care poartă alele HLA bine definite. Un aspect deosebit de important în realizarea tipajului HLA bazat pe analiza ADN este legat de luarea tuturor precauțiilor pentru evitarea contaminării probelor cu ADN anterior amplificat. De asemenea, matrița ADN ce urmează a fi copiată în procesul
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
analiza ADN de mai mică rezoluție (generic sau serologic) realizează un rezultat care aparent este similar tipajului serologic, așa cum rezultă din tabelul 12.1. Nivelul intermediar de rezoluție bazat pe analiza ADN îngustează incertitudinea prin indicarea mai exactă a unor alele ce ar putea fi purtate de individul testat (vezi în tabel DRB1*0402 sau DRB1*0414). Nivelul cel mai înalt de rezoluție este cel în care este determinată alela purtată de individ în regiunea CMH, fără echivoc (tabelul 12.1
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
pe analiza ADN îngustează incertitudinea prin indicarea mai exactă a unor alele ce ar putea fi purtate de individul testat (vezi în tabel DRB1*0402 sau DRB1*0414). Nivelul cel mai înalt de rezoluție este cel în care este determinată alela purtată de individ în regiunea CMH, fără echivoc (tabelul 12.1). Similitudinea dintre locii genici HLA și alelele HLA adaugă un plus de complexitate și dificultate în identificarea moleculelor HLA și a genelor codificatoare corespunzătoare. Există numeroase argumente în sprijinul
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
individul testat (vezi în tabel DRB1*0402 sau DRB1*0414). Nivelul cel mai înalt de rezoluție este cel în care este determinată alela purtată de individ în regiunea CMH, fără echivoc (tabelul 12.1). Similitudinea dintre locii genici HLA și alelele HLA adaugă un plus de complexitate și dificultate în identificarea moleculelor HLA și a genelor codificatoare corespunzătoare. Există numeroase argumente în sprijinul ipotezei potrivit căreia locii genici HLA au rezultat în urma mecanismului duplicației genice, pornind de la o singură genă primordială
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
a genelor codificatoare corespunzătoare. Există numeroase argumente în sprijinul ipotezei potrivit căreia locii genici HLA au rezultat în urma mecanismului duplicației genice, pornind de la o singură genă primordială copiile rezultate suferind diversificare prin mutație și recombinare genetică între locii genici și alele. Această origine graduală (geneză succesivă) a alelelor HLA impune ca aplicarea metodologiei de tipare bazată pe analiza ADN să se bazeze pe o abordare în mai multe etape în procedura de identificare a alelelor HLA. În cadrul unei asemenea abordări este
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
în sprijinul ipotezei potrivit căreia locii genici HLA au rezultat în urma mecanismului duplicației genice, pornind de la o singură genă primordială copiile rezultate suferind diversificare prin mutație și recombinare genetică între locii genici și alele. Această origine graduală (geneză succesivă) a alelelor HLA impune ca aplicarea metodologiei de tipare bazată pe analiza ADN să se bazeze pe o abordare în mai multe etape în procedura de identificare a alelelor HLA. În cadrul unei asemenea abordări este utilizat un set de primeri PCR pentru
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
recombinare genetică între locii genici și alele. Această origine graduală (geneză succesivă) a alelelor HLA impune ca aplicarea metodologiei de tipare bazată pe analiza ADN să se bazeze pe o abordare în mai multe etape în procedura de identificare a alelelor HLA. În cadrul unei asemenea abordări este utilizat un set de primeri PCR pentru a se realiza amplificarea tuturor alelelor dintr-un anumit locus HLA. Utilizând un ansamblu de probe oligonucleotidice se pot obține rezultate de tipaj de rezoluție redusă sau
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
de tipare bazată pe analiza ADN să se bazeze pe o abordare în mai multe etape în procedura de identificare a alelelor HLA. În cadrul unei asemenea abordări este utilizat un set de primeri PCR pentru a se realiza amplificarea tuturor alelelor dintr-un anumit locus HLA. Utilizând un ansamblu de probe oligonucleotidice se pot obține rezultate de tipaj de rezoluție redusă sau intermediară. Pe baza acestor rezultate vor putea fi selectați primeri care asigură amplificarea doar a unui anumit subset de
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
dintr-un anumit locus HLA. Utilizând un ansamblu de probe oligonucleotidice se pot obține rezultate de tipaj de rezoluție redusă sau intermediară. Pe baza acestor rezultate vor putea fi selectați primeri care asigură amplificarea doar a unui anumit subset de alele sau doar a uneia dintre cele două alele existente în locusul genic HLA al unui anumit individ. Un al doilea set de oligonucleotide poate fi utilizat în identificarea alelei prezente în materialul testat. Atât în tipajul serologic cât și în
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
de probe oligonucleotidice se pot obține rezultate de tipaj de rezoluție redusă sau intermediară. Pe baza acestor rezultate vor putea fi selectați primeri care asigură amplificarea doar a unui anumit subset de alele sau doar a uneia dintre cele două alele existente în locusul genic HLA al unui anumit individ. Un al doilea set de oligonucleotide poate fi utilizat în identificarea alelei prezente în materialul testat. Atât în tipajul serologic cât și în cel bazat pe analiza ADN pot apare erori
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]
-
selectați primeri care asigură amplificarea doar a unui anumit subset de alele sau doar a uneia dintre cele două alele existente în locusul genic HLA al unui anumit individ. Un al doilea set de oligonucleotide poate fi utilizat în identificarea alelei prezente în materialul testat. Atât în tipajul serologic cât și în cel bazat pe analiza ADN pot apare erori, după cum pot apare discrepanțe în tipajul HLA generate de tehnica utilizată și de metodele aplicate. De aceea, tipajul HLA trebuie să
Imunogenetică și oncogenetică. Principii de imunogenetică. Partea I by Lucian Gavrilă, Aurel Ardelean () [Corola-publishinghouse/Science/91987_a_92482]