6,925 matches
-
de ex. Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) sau un amestec de fenobarbitonă și β-naftoflavonă (10) (11) (12). Fracția postmitocondrială se utilizează, de obicei, la concentrații cuprinse între limitele 1-10% vol./ vol. în mediul experimental final. Compoziția unui sistem de activare metabolic poate să depindă de clasa din care face parte substanța chimică de testat. În unele cazuri, s-ar putea să fie convenabilă utilizarea mai multor concentrații ale fracției postmitocondriale. O serie de realizări, inclusiv crearea prin inginerie genetică a
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
testat. În unele cazuri, s-ar putea să fie convenabilă utilizarea mai multor concentrații ale fracției postmitocondriale. O serie de realizări, inclusiv crearea prin inginerie genetică a unor linii celulare care exprimă enzime activatoare specifice, poate furniza potențialul pentru o activare endogenă. Alegerea liniilor celulare ar trebui să fie justificată din punct de vedere științific (de ex. prin importanța izoenzimei citocromului P450 pentru metabolismul substanței de testat). 1.4.1.5. Substanța de testat/prepararea Substanțele de testat în stare solidă
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
4.2.2. Concentrațiile de expunere Printre criteriile ce trebuie să fie avute în vedere la determinarea dozei maxime sunt citotoxicitatea, solubilitatea în sistemul experimental și modificările de pH sau osmolalitate. Citotoxicitatea ar trebui să se determine cu și fără activare metabolică în experimentarea principală, utilizând un indicator corespunzător al integrității și dezvoltării celulare, ca gradul de confluență, numărul de celule viabile sau indexul mitotic. Ar putea fi utilă determinarea citotoxicității și solubilității într-un test preliminar. Ar trebui să se
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
liber. Ar trebui ca precipitarea să nu interfereze cu determinarea rezultatelor. 1.4.2.3. Martorii negativi și pozitivi La fiecare experiment, ar trebui să se includă simultan martorii pozitivi și negativi (solvent și vehicul), atât cu, cât și fără activare metabolică. În prezența unui sistem de activare metabolică, substanța utilizată ca martor pozitiv ar trebui să fie aceea care necesită activare pentru a da un răspuns mutagen. Ca martori pozitivi ar trebui să se utilizeze un elastogen cunoscut, la niveluri
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
interfereze cu determinarea rezultatelor. 1.4.2.3. Martorii negativi și pozitivi La fiecare experiment, ar trebui să se includă simultan martorii pozitivi și negativi (solvent și vehicul), atât cu, cât și fără activare metabolică. În prezența unui sistem de activare metabolică, substanța utilizată ca martor pozitiv ar trebui să fie aceea care necesită activare pentru a da un răspuns mutagen. Ca martori pozitivi ar trebui să se utilizeze un elastogen cunoscut, la niveluri de expunere care se estimează că determină
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
experiment, ar trebui să se includă simultan martorii pozitivi și negativi (solvent și vehicul), atât cu, cât și fără activare metabolică. În prezența unui sistem de activare metabolică, substanța utilizată ca martor pozitiv ar trebui să fie aceea care necesită activare pentru a da un răspuns mutagen. Ca martori pozitivi ar trebui să se utilizeze un elastogen cunoscut, la niveluri de expunere care se estimează că determină o creștere reproductibilă și detectabilă în raport cu zgomotul de fond, ceea ce demonstrează sensibilitatea sistemului de
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
Concentrațiile martorilor pozitivi ar trebui să fie selectate astfel încât să se obțină efecte clare, dar care să nu permită identificare imediată a lamelelor codificate. În tabelul următor se prezintă exemple de substanțe care se pot utiliza ca martori pozitivi: Starea activării metabolice Substanța Nr. CAS Nr. IESCE Absența activării metabolice exogene metansulfonat de metil 66-27-3 200-625-0 metansulfonat de etil 62-50-0 200-536-7 etil nitrozouree 759-73-9 212-072-2 mitomicină C 50-07-7 200-008-6 4-nitrochinolină-N-oxid 56-57-5 200-281-1 Prezența activării metabolice exogene benzo[a] piren 50-32-8 200-028-5
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
astfel încât să se obțină efecte clare, dar care să nu permită identificare imediată a lamelelor codificate. În tabelul următor se prezintă exemple de substanțe care se pot utiliza ca martori pozitivi: Starea activării metabolice Substanța Nr. CAS Nr. IESCE Absența activării metabolice exogene metansulfonat de metil 66-27-3 200-625-0 metansulfonat de etil 62-50-0 200-536-7 etil nitrozouree 759-73-9 212-072-2 mitomicină C 50-07-7 200-008-6 4-nitrochinolină-N-oxid 56-57-5 200-281-1 Prezența activării metabolice exogene benzo[a] piren 50-32-8 200-028-5 ciclofosfamidă 50-18-0 200-015-4 ciclofosfamidă monohidrat 6055-19-2 Se pot
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
se pot utiliza ca martori pozitivi: Starea activării metabolice Substanța Nr. CAS Nr. IESCE Absența activării metabolice exogene metansulfonat de metil 66-27-3 200-625-0 metansulfonat de etil 62-50-0 200-536-7 etil nitrozouree 759-73-9 212-072-2 mitomicină C 50-07-7 200-008-6 4-nitrochinolină-N-oxid 56-57-5 200-281-1 Prezența activării metabolice exogene benzo[a] piren 50-32-8 200-028-5 ciclofosfamidă 50-18-0 200-015-4 ciclofosfamidă monohidrat 6055-19-2 Se pot utiliza și alte substanțe corespunzătoare ca martori pozitivi. Ar trebui să se aibă în vedere utilizarea ca martori pozitivi a unor substanțe din aceeași clasă
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
selectat nu prezintă efecte vătămătoare sau mutagene. 1.4.3. Modul de lucru 1.4.3.1. Tratamentul cu substanța de testat Celulele în stadiu de proliferare se tratează cu substanța de testat în prezența sau absența unui sistem de activare metabolică. Tratamentul limfocitelor ar trebui să înceapă la aproximativ 48 de ore de la stimularea mitogenică. 1.4.3.2. Pentru fiecare concentrație ar trebui să se realizeze în mod normal teste pe culturi de celule în dublu exemplar, procedură recomandată
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
metode corespunzătoare, de exemplu în vase de cultură închise ermetic (15) (16). 1.4.3.3. Momentul recoltării culturilor În primul experiment, expunerea celulelor la substanța de încercat ar trebui să se realizeze atât în prezența, cât și în absența activării metabolice, timp de 3-6 ore, și să se procedeze la prelevarea probelor după un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal de la inițierea tratamentului (12). Dacă rezultatele testului sunt negative, atât în prezența, cât
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
3-6 ore, și să se procedeze la prelevarea probelor după un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal de la inițierea tratamentului (12). Dacă rezultatele testului sunt negative, atât în prezența, cât și în absența activării, ar trebui să se repete testul fără activare, cu tratament continuu până în momentul prelevării probelor care să fie egal cu aproximativ de 1,5 ori durata ciclului celular normal. S-ar putea ca unele produse chimice să fie detectate mai
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
probelor după un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal de la inițierea tratamentului (12). Dacă rezultatele testului sunt negative, atât în prezența, cât și în absența activării, ar trebui să se repete testul fără activare, cu tratament continuu până în momentul prelevării probelor care să fie egal cu aproximativ de 1,5 ori durata ciclului celular normal. S-ar putea ca unele produse chimice să fie detectate mai ușor, prin prelungirea timpului de tratament/prelevare a
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
ori durata ciclului celular normal. S-ar putea ca unele produse chimice să fie detectate mai ușor, prin prelungirea timpului de tratament/prelevare a probelor la mai mult de 1,5 ori durata ciclului celular. Rezultatele negative obținute în prezența activării metabolice necesită o confirmare pentru fiecare caz. Pentru cazurile în care se consideră că nu este necesară confirmarea rezultatelor negative, trebuie să se prezinte o justificare. 1.4.3.4. Prepararea cromozomilor Culturile celulare se tratează cu Colcemid(r) sau
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
a discutat la punctul 1.4.3.3. În cazul experimentelor suplimentare, ar trebui să se aibă în vedere modificările parametrilor cercetați pentru a extinde gama condițiilor evaluate. Parametrii studiați, susceptibili de modificare, includ intervalele dintre concentrații și condițiile de activare metabolică. 2.2. EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o creștere în funcție de concentrație sau o creștere reproductibilă a numărului de celule cu aberații cromozomiale. În primul rând, ar trebui să se aibă în
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
compoziția mediului, concentrația de CO2, dacă este cazul, - concentrația substanței de testat, - volumul vehiculului și al substanței de testat adăugate, - temperatura de incubare, - timpul de incubare, - durata tratamentului, - densitatea celulară la însămânțare, dacă este cazul, - tipul și compoziția sistemului de activare metabolică, inclusiv criteriile de acceptabilitate, - martorii pozitivi și negativi, - metodele de preparare a lamelelor, - criteriile pentru numărătoarea aberațiilor, - numărul de metafaze analizate, - metodele de măsurare a toxicității, - criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure. Rezultatele: - semnele
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
3. CONSIDERAȚII PRELIMINARE Testul bacterian de mutație inversă utilizează celule procariote, care diferă de celulele mamiferelor în privința absorbției, metabolismului, structurii cromozomilor și proceselor de regenerare a ADN. Pentru testele realizate in vitro este necesară în general o sursă exogenă de activare metabolică. Sistemele de activare metabolică in vitro nu pot să reproducă în totalitate condițiile metabolismului celulelor de mamifere in vivo. Testul nu furnizează, prin urmare, informații directe privind capacitatea mutagenă și cancerigenă a unei substanțe la mamifere. Testul bacterian de
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
bacterian de mutație inversă utilizează celule procariote, care diferă de celulele mamiferelor în privința absorbției, metabolismului, structurii cromozomilor și proceselor de regenerare a ADN. Pentru testele realizate in vitro este necesară în general o sursă exogenă de activare metabolică. Sistemele de activare metabolică in vitro nu pot să reproducă în totalitate condițiile metabolismului celulelor de mamifere in vivo. Testul nu furnizează, prin urmare, informații directe privind capacitatea mutagenă și cancerigenă a unei substanțe la mamifere. Testul bacterian de mutație inversă se utilizează
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
multe produse chimice care dau rezultate pozitive în prezentul test prezintă activitate mutagenă și în alte teste. Există exemple de agenți mutageni care nu se detectează prin acest test; aceste deficiențe se pot explica prin natura specifică a efectului detectat, activării metabolice diferite sau biodisponibilității diferite. Pe de altă parte, factorii care cresc sensibilitatea testului bacterian de mutație inversă pot să conducă la o supraestimare a activității mutagene. S-ar putea ca testul bacterian de mutație inversă să nu fie potrivit
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
deoarece acționează prin alte mecanisme negenotoxice sau mecanisme care nu sunt prezente în celulele bacteriene. 1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Suspensiile de celule bacteriene sunt expuse la substanța de testat în prezența și în absența unui sistem exogen de activare metabolică. În procedeul de încorporare prin depunere pe o placă, suspensiile menționate se amestecă cu o geloză de acoperire (agar) și se depun imediat pe un mediu minimal. În procedeul cu preincubare, amestecul de tratare se incubează și apoi se
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
pentru testarea substanțelor în stare gazoasă sau de vapori (12). În prezenta metodă se descrie modul de lucru pentru procedeul de încorporare prin depunere și pentru cel cu preincubare. Oricare dintre acestea se poate accepta pentru realizarea experimentelor, atât cu activare metabolică, cât și fără aceasta. Pentru unele substanțe, este mai eficientă detectarea prin procedeul cu preincubare. Substanțele respective aparțin unor clase chimice care includ nitrozamine alifatice cu lanț scurt, metale bivalente, aldehide, coloranți azoici și diazoderivații, alcaloizi ai pirolizidinei, compuși
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
ex. una care conține mediu minimal E Vogel-Bonner și glucoză) și o geloză de acoperire care conține histidină și biotin sau triptofan pentru a permite divizarea doar a unui număr mic de celule (1) (2) (9). 1.5.1.3. Activarea metabolică Expunerea bacteriilor la substanța de testat ar trebui să se realizeze atât în prezența, cât și în absența unui sistem corespunzător de activare metabolică. Sistemul utilizat cel mai frecvent conține o fracție post mitocondrială îmbogățită cu un cofactor (S9
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
permite divizarea doar a unui număr mic de celule (1) (2) (9). 1.5.1.3. Activarea metabolică Expunerea bacteriilor la substanța de testat ar trebui să se realizeze atât în prezența, cât și în absența unui sistem corespunzător de activare metabolică. Sistemul utilizat cel mai frecvent conține o fracție post mitocondrială îmbogățită cu un cofactor (S9), preparată din ficat de rozătoare tratat cu agenți de inducție enzimatică, de ex. Aroclor 1254 (1) (2) sau un amestec de fenobarbitonă și β-naftoflavonă
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
de ex. Aroclor 1254 (1) (2) sau un amestec de fenobarbitonă și β-naftoflavonă (18) (20) (21). Fracția postmitocondrială se utilizează, de obicei, la concentrații cuprinse între 5 și 30% vol./ vol. în amestecul S9. Alegerea și compoziția unui sistem de activare metabolică pot să depindă de clasa chimică a substanței de testat. În unele cazuri, s-ar putea să fie convenabilă utilizarea mai multor concentrații ale fracției postmitocondriale. Pentru coloranții azoici și diazoderivați, s-ar putea să fie mai potrivită utilizarea
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
depindă de clasa chimică a substanței de testat. În unele cazuri, s-ar putea să fie convenabilă utilizarea mai multor concentrații ale fracției postmitocondriale. Pentru coloranții azoici și diazoderivați, s-ar putea să fie mai potrivită utilizarea unui sistem de activare metabolică reducător (6) (13). 1.5.1.4. Substanța de testat/prepararea Substanțele de testat în stare solidă ar trebui să se prepare sub formă de soluții sau suspensii în solvenții sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]