6,925 matches
-
determinarea toxicității și caracteristicilor de solubilitate. Detectarea citotoxicității poate fi posibilă printr-o reducere a numărului de colonii care provoacă reversia, o clarificare și diminuare a fondului de bacterii sau a gradului de supraviețuire a culturilor tratate. Prezența sistemelor de activare metabolică poate să influențeze citotoxicitatea unei substanțe. Insolubilitatea ar trebui să fie evaluată prin formarea în amestecul final, în condiții de testare reale, a unui precipitat vizibil cu ochiul liber. Concentrația de testare maximă recomandată pentru substanțele necitotoxice solubile este
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
placă sau 5μl/placă. 1.5.2.3. Martorii negativi și pozitivi Martorii pozitivi specifici sușei și martorii negativi (solvent sau vehicul) utilizați în paralel, ar trebui să se includă în fiecare test, atât în prezența, cât și în absența activării metabolice. Pentru martorii pozitivi, ar trebui să fie selectate acele concentrații care permit să se demonstreze eficiența testului realizat. Pentru testele care utilizează un sistem de activare metabolică, selectarea substanței sau substanțelor de referință pentru martorii pozitivi ar trebui să
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
să se includă în fiecare test, atât în prezența, cât și în absența activării metabolice. Pentru martorii pozitivi, ar trebui să fie selectate acele concentrații care permit să se demonstreze eficiența testului realizat. Pentru testele care utilizează un sistem de activare metabolică, selectarea substanței sau substanțelor de referință pentru martorii pozitivi ar trebui să se realizeze în funcție de tipul sușelor bacteriene utilizate. În tabelul următor sunt prezentate exemple de substanțe care se pot utiliza ca martori pozitivi pentru testele cu activare metabolică
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
de activare metabolică, selectarea substanței sau substanțelor de referință pentru martorii pozitivi ar trebui să se realizeze în funcție de tipul sușelor bacteriene utilizate. În tabelul următor sunt prezentate exemple de substanțe care se pot utiliza ca martori pozitivi pentru testele cu activare metabolică: Substanța Nr. CAS Nr. IESCE 9,10-dimetilantracen 781-43-1 212-308-4 7,12-dimetilbenz[a]antracen 57-97-6 200-359-5 benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 2-aminoantracen 613-13-8 210-330-9 ciclofosfamidă 50-18-0 200-015-4 ciclofosfamidă monohidrat 6055-19-2 Următoarea substanță este un martor pozitiv adecvat pentru metoda de
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
metabolică: Substanța Nr. CAS Nr. IESCE 9,10-dimetilantracen 781-43-1 212-308-4 7,12-dimetilbenz[a]antracen 57-97-6 200-359-5 benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 2-aminoantracen 613-13-8 210-330-9 ciclofosfamidă 50-18-0 200-015-4 ciclofosfamidă monohidrat 6055-19-2 Următoarea substanță este un martor pozitiv adecvat pentru metoda de activare metabolică reductivă: Substanța Nr. CAS Nr. IESCE Roșu de Congo 573-58-0 209-358-4 2-aminoantracenul nu ar trebui să se utilizeze ca indicator unic al eficienței amestecului S9. Dacă se utilizează 2-aminoantracenul, fiecare lot de S9 ar trebui să fie, de asemenea
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
Roșu de Congo 573-58-0 209-358-4 2-aminoantracenul nu ar trebui să se utilizeze ca indicator unic al eficienței amestecului S9. Dacă se utilizează 2-aminoantracenul, fiecare lot de S9 ar trebui să fie, de asemenea, caracterizat cu un mutagen care necesită o activare metabolică de către enzimele microzomiale, de ex. benzo[a]pirenul, dimetilbenzantracenul. În tabelul următor sunt prezentate exemple de substanțe care se pot utiliza ca martori pozitivi specifici sușei pentru testele realizate fără un sistem de activare metabolică exogenă: Substanța Nr. CAS
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
un mutagen care necesită o activare metabolică de către enzimele microzomiale, de ex. benzo[a]pirenul, dimetilbenzantracenul. În tabelul următor sunt prezentate exemple de substanțe care se pot utiliza ca martori pozitivi specifici sușei pentru testele realizate fără un sistem de activare metabolică exogenă: Substanța Nr. CAS Nr. IESCE Sușa azidă de sodiu 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 și TA 100 2-nitrofluoren 607-57-8 210-138-5 TA 98 9-aminoacridină 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 și TA 97a ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
cazului în care există date din testele anterioare care să ateste că solventul ales nu are efecte dăunătoare sau mutagene. 1.5.3. Modul de lucru Pentru metoda de încorporare prin depunere pe o placă (1) (2) (3) (4), fără activare metabolică, se prepară, de obicei, un amestec din 0,05 ml sau 0,1 ml de soluție de testat, 0,1 ml de cultură bacteriană proaspătă (ce conține aproximativ 108 celule viabile) și 0,5 ml de tampon steril cu
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
ml sau 0,1 ml de soluție de testat, 0,1 ml de cultură bacteriană proaspătă (ce conține aproximativ 108 celule viabile) și 0,5 ml de tampon steril cu 2,0 ml geloză de acoperire (agar). Pentru testul cu activare metabolică, se prepară, de obicei, un amestec din 0,5 ml preparat de activare metabolică, ce conține o cantitate specifică de fracție postmitocondrială (în proporție de 5 până la 30% vol./ vol. în preparatul de activare metabolică), 2,0 ml de
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
bacteriană proaspătă (ce conține aproximativ 108 celule viabile) și 0,5 ml de tampon steril cu 2,0 ml geloză de acoperire (agar). Pentru testul cu activare metabolică, se prepară, de obicei, un amestec din 0,5 ml preparat de activare metabolică, ce conține o cantitate specifică de fracție postmitocondrială (în proporție de 5 până la 30% vol./ vol. în preparatul de activare metabolică), 2,0 ml de geloză de acoperire, bacterii și substanța de testat/soluția de testat. Conținutul din fiecare
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
acoperire (agar). Pentru testul cu activare metabolică, se prepară, de obicei, un amestec din 0,5 ml preparat de activare metabolică, ce conține o cantitate specifică de fracție postmitocondrială (în proporție de 5 până la 30% vol./ vol. în preparatul de activare metabolică), 2,0 ml de geloză de acoperire, bacterii și substanța de testat/soluția de testat. Conținutul din fiecare eprubetă se agită și se toarnă pe suprafața unui mediu minimal de geloză depus pe placă. Geloza de acoperire se lasă
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
lasă să se solidifice înainte de incubare. Pentru metoda de preincubare (2) (3) (5) (6), substanța de testat/soluția de testat se supune la preincubare împreună cu sușa experimentală (ce conține aproximativ 108 celule viabile) și cu tamponul steril sau sistemul de activare metabolică (0,5 ml) de obicei timp de 20 de minute sau mai mult, la 30-37oC, înainte de a fi amestecată cu geloza de acoperire și turnată pe suprafața unui mediu minimal de geloză depus pe placă. De obicei, se prepară
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
se aibă în vedere modificarea condițiilor experimentale pentru lărgirea gamei de condiții evaluate. Condițiile experimentale care ar putea fi modificate includ diferența dintre concentrații, metoda de tratament (încorporarea prin depunere pe placă sau preincubarea în mediu lichid) și condițiile de activare metabolică. 2.2. EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, precum creșterea în funcție de concentrație peste intervalul testat și/sau o creștere reproductibilă a uneia sau mai multor concentrații ale numărului de colonii care provoacă reversia
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
unui rezultat pozitiv, precum creșterea în funcție de concentrație peste intervalul testat și/sau o creștere reproductibilă a uneia sau mai multor concentrații ale numărului de colonii care provoacă reversia per placă, la cel puțin o sușă cu sau fără sistem de activare metabolică (23). În primul rând ar trebui să se aibă în vedere relevanța biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge și la ajutorul unor metode statistice (24). Semnificația statistică nu ar trebui să fie totuși singurul factor
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
utilizate, - numărul de celule per cultură, - caracteristicile sușei, Condițiile de testare: - cantitatea de substanță de testat per placă (mg/placă sau μl/placă) cu justificarea alegerii dozei și numărului de plăci per concentrație, - mediile utilizate, - tipul și compoziția sistemului de activare metabolică, inclusiv criteriile de acceptabilitate, - procedurile de tratament. Rezultatele: - semnele de toxicitate, - semnele de precipitare, - numărătoarea pentru fiecare placă, - numărul mediu de colonii care provoacă reversia pentru fiecare placă și deviația standard - relația doză-răspuns, dacă este posibil, - analizele statistice, dacă
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
se pot utiliza culturi de linii celulare stabilite sau sușe celulare. Celule utilizate se selectează în funcție de capacitatea de creștere în cultură și de stabilitatea frecvenței de mutație spontană. Testele realizate in vitro necesită, în general, utilizarea unei surse exogene de activare metabolică. Sistemul de activare metabolică de acest tip nu poate să reproducă integral condițiile celulelor de mamifere in vivo. Ar trebui să se acorde atenție evitării condițiilor care ar putea să conducă la obținerea unor rezultate care nu reflectă o
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
de linii celulare stabilite sau sușe celulare. Celule utilizate se selectează în funcție de capacitatea de creștere în cultură și de stabilitatea frecvenței de mutație spontană. Testele realizate in vitro necesită, în general, utilizarea unei surse exogene de activare metabolică. Sistemul de activare metabolică de acest tip nu poate să reproducă integral condițiile celulelor de mamifere in vivo. Ar trebui să se acorde atenție evitării condițiilor care ar putea să conducă la obținerea unor rezultate care nu reflectă o mutagenitate intrinsecă. Rezultatele pozitive
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
atunci când se testează substanțe chimice cu o structură apropiată de cea a agentului selectiv (8). Celulele în suspensie sau în cultură monostrat se expun o perioadă de timp corespunzătoare la substanța de testat atât în prezența, cât și în absența activării metabolice și se reînsămânțează pentru determinarea citotoxicității și pentru a permite manifestarea fenotipului înaintea selecției mutantului (9) (10) (11) (12) (13). Citotoxicitatea se determină, de obicei, prin măsurarea eficacității clonării relative (supraviețuirii) sau a creșterii totale relative a culturilor după
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
Prepararea culturilor Celulele se obțin plecând de la culturile de rezervă, se însămânțează în mediul de cultură și se incubează la 37oC. Înainte de a fi utilizate în prezentul test, este necesară curățarea culturilor de celulele mutante preexistente. 1.4.1.4. Activarea metabolică Se recomandă ca expunerea celulelor la substanța de testat să se realizeze atât în prezența, cât și în absența unui sistem de activare metabolică corespunzător. Sistemul cel mai frecvent utilizat este o fracție postmitocondrială la care s-au adăugat
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
utilizate în prezentul test, este necesară curățarea culturilor de celulele mutante preexistente. 1.4.1.4. Activarea metabolică Se recomandă ca expunerea celulelor la substanța de testat să se realizeze atât în prezența, cât și în absența unui sistem de activare metabolică corespunzător. Sistemul cel mai frecvent utilizat este o fracție postmitocondrială la care s-au adăugat cofactori (S9), preparată din ficat de rozătoare tratat cu agenți de inducție enzimatică, de ex. Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) sau un amestec
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) sau un amestec de fenobarbitonă și β-naftoflavonă (19) (20). Fracția post-mitocondrială se utilizează, de obicei, la concentrații cuprinse între limitele 1-10% vol./ vol. în mediul de testare final. Selectarea și tipul unui sistem de activare metabolică poate să depindă de clasa chimică a substanței de testat. În unele cazuri, ar putea fi convenabilă utilizarea mai multor concentrații ale fracției postmitocondriale. O serie de realizări, inclusiv crearea prin inginerie genetică a unor linii celulare care exprimă
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
de testat. În unele cazuri, ar putea fi convenabilă utilizarea mai multor concentrații ale fracției postmitocondriale. O serie de realizări, inclusiv crearea prin inginerie genetică a unor linii celulare care exprimă enzime activatoare specifice, pot să furnizeze potențialul pentru o activare endogenă. Alegerea liniilor celulare ar trebui să fie justificată din punct de vedere științific (de ex. prin importanța izoenzimei citocromului P450 pentru metabolismul substanței de testat). 1.4.1.5. Prepararea substanței de testat Substanțele de testat în stare solidă
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
2.2 Concentrațiile de expunere Printre criteriile ce trebuie să fie avute în vedere la determinarea dozei maxime sunt citotoxicitatea, solubilitatea în sistemul de testare și modificările de pH sau osmolalitate. Citotoxicitatea ar trebui să se determine cu și fără activare metabolică în experimentul principal, utilizând un indicator corespunzător al integrității și dezvoltării celulare, ca eficacitatea clonării relative (supraviețuirea) sau creșterea totală relativă. Ar putea fi utilă determinarea citotoxicității și solubilității într-un experiment preliminar. Ar trebui să se utilizeze cel
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
constata cu ochiul liber. Ar trebui ca precipitarea să nu interfereze cu determinarea rezultatelor. 1.4.2.3 Martorii În fiecare experiment, ar trebui să se includă simultan martorii pozitivi și negativi (solvent și vehicul), atât cu, cât și fără activare metabolică. În prezența activării metabolice, substanța utilizată ca martor pozitiv ar trebui să fie aceea care necesită activare pentru a da un răspuns mutagen. În tabelul următor sunt prezentate exemple de substanțe utilizate ca martori pozitivi: Tipul activării Poziția Substanța
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
Ar trebui ca precipitarea să nu interfereze cu determinarea rezultatelor. 1.4.2.3 Martorii În fiecare experiment, ar trebui să se includă simultan martorii pozitivi și negativi (solvent și vehicul), atât cu, cât și fără activare metabolică. În prezența activării metabolice, substanța utilizată ca martor pozitiv ar trebui să fie aceea care necesită activare pentru a da un răspuns mutagen. În tabelul următor sunt prezentate exemple de substanțe utilizate ca martori pozitivi: Tipul activării Poziția Substanța Nr. CAS Nr. IESCE
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]