9,135 matches
-
contaminării tamponului sau în cazul în care celulele pozitive sunt izolate (în exteriorul ferestrelor) pe mediul de montare al lamei. 4.4.3. Există un anumit număr de probleme inerente specificității testului de imunofluorescență. Există un risc ridicat ca în extractele de conuri de stoloni și de segmente de tulpini de cartof să apară populații nedorite de celule fluorescente, atipice din punct de vedere morfologic și populații de bacterii saprofite care provoacă reacții încrucișate și au dimensiune și morfologie similare cu
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
Interpretarea testului de imunofluorescență: (i) În cazul în care proba conține celule care prezintă o fluorescență vie și o morfologie caracteristică, se evaluează numărul mediu de celule caracteristice pe câmp microscopic și se calculează numărul celulelor menționate pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie (a se vedea apendicele 4). Testul de imunofluorescență este considerat pozitiv atunci când eșantionul conține cel puțin 5 x 103 celule caracteristice pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie. În acest caz, eșantionul este considerat ca
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
câmp microscopic și se calculează numărul celulelor menționate pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie (a se vedea apendicele 4). Testul de imunofluorescență este considerat pozitiv atunci când eșantionul conține cel puțin 5 x 103 celule caracteristice pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie. În acest caz, eșantionul este considerat ca fiind potențial contaminat și trebuie continuate testele. (ii) Testul de imunofluorescență este considerat negativ atunci când eșantionul conține mai puțin de 5 x 103 celule pe mililitru de extract concentrat
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
de extract concentrat repus în suspensie. În acest caz, eșantionul este considerat ca fiind potențial contaminat și trebuie continuate testele. (ii) Testul de imunofluorescență este considerat negativ atunci când eșantionul conține mai puțin de 5 x 103 celule pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie și proba este considerată necontaminată. Nu este necesară continuarea testelor. 5. TESTUL FISH Principiu În cazul în care testul FISH este folosit ca test de depistare inițial și rezultatul său este pozitiv, trebuie să se efectueze
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
funcțională. Nota bene: Se utilizează oligosonde validate specifice C. m. ssp. sepedonicus (a se vedea apendicele 7). Testele preliminarii efectuate prin această metodă trebuie să permită detectarea reproductibilă a cel puțin 103-104 celule/ml de C. m. ssp. sepedonicus adăugate extractelor de probe care au dus anterior la rezultate negative. Este preferabil să se aplice procedura descrisă în continuare pentru extractele de probă proaspăt preparate, dar procedura poate funcționa, de asemenea, cu extracte de probă conservate în soluție de glicerol la
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
prin această metodă trebuie să permită detectarea reproductibilă a cel puțin 103-104 celule/ml de C. m. ssp. sepedonicus adăugate extractelor de probe care au dus anterior la rezultate negative. Este preferabil să se aplice procedura descrisă în continuare pentru extractele de probă proaspăt preparate, dar procedura poate funcționa, de asemenea, cu extracte de probă conservate în soluție de glicerol la temperaturi între -16 °C și -24 °C sau între -68 °C și -86 °C. Ca martori negativi se folosesc alicote
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
celule/ml de C. m. ssp. sepedonicus adăugate extractelor de probe care au dus anterior la rezultate negative. Este preferabil să se aplice procedura descrisă în continuare pentru extractele de probă proaspăt preparate, dar procedura poate funcționa, de asemenea, cu extracte de probă conservate în soluție de glicerol la temperaturi între -16 °C și -24 °C sau între -68 °C și -86 °C. Ca martori negativi se folosesc alicote de extract de probă care au dus în prealabil la un rezultat
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
probă proaspăt preparate, dar procedura poate funcționa, de asemenea, cu extracte de probă conservate în soluție de glicerol la temperaturi între -16 °C și -24 °C sau între -68 °C și -86 °C. Ca martori negativi se folosesc alicote de extract de probă care au dus în prealabil la un rezultat negativ, cu ocazia testelor de depistare a C. m. ssp. sepedonicus. Ca martori pozitivi se prepară suspensii care conțin între 105 și 106 celule/ml de C. m. ssp. sepedonicus
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
baza unei culturi de trei până la cinci zile (a se vedea apendicele 2 pentru preparare). Se prepară lame martori pozitivi distincte ale sușei omoloage sau ale oricărei alte sușe de referință de C. m. ssp. sepedonicus într-o suspensie de extract de cartof, astfel cum se indică în apendicele 2. Utilizarea unei oligosonde eubacteriene marcate cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) permite controlarea procesului de hibridizare, colorând toate eubacteriile prezente în probă. Materialul de control se testează la fel ca și probele
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
cum se indică în apendicele 2. Utilizarea unei oligosonde eubacteriene marcate cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) permite controlarea procesului de hibridizare, colorând toate eubacteriile prezente în probă. Materialul de control se testează la fel ca și probele. 5.1. Fixarea extractului de cartof Protocolul prezentat în cele ce urmează se bazează pe Wullings et al. (1998). 5.1.1. Se prepară soluția de fixare (a se vedea apendicele 7). 5.1.2. Se introduc cu pipeta 100 μl din fiecare extract
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
extractului de cartof Protocolul prezentat în cele ce urmează se bazează pe Wullings et al. (1998). 5.1.1. Se prepară soluția de fixare (a se vedea apendicele 7). 5.1.2. Se introduc cu pipeta 100 μl din fiecare extract într-un tub Eppendorf și sunt centrifugați timp de 8 minute la 7 000 g. 5.1.3. Se elimină lichidul supernatant și se dizolvă extractul concentrat în 500 μl de fixativ preparat cu mai puțin de 24 de ore
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
vedea apendicele 7). 5.1.2. Se introduc cu pipeta 100 μl din fiecare extract într-un tub Eppendorf și sunt centrifugați timp de 8 minute la 7 000 g. 5.1.3. Se elimină lichidul supernatant și se dizolvă extractul concentrat în 500 μl de fixativ preparat cu mai puțin de 24 de ore înainte. Se agită și se lasă la incubat toată noaptea la 4 °C. Se mai poate utiliza ca fixativ etanol la 96 %. În acest caz, extractul
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
extractul concentrat în 500 μl de fixativ preparat cu mai puțin de 24 de ore înainte. Se agită și se lasă la incubat toată noaptea la 4 °C. Se mai poate utiliza ca fixativ etanol la 96 %. În acest caz, extractul concentrat menționat la punctul 5.1.2 se dizolvă într-un amestec format din 50 μl de tampon fosfatat la 0,01 M și din 50 μl etanol la 96 %. Se amestecă la vortex și se lasă la incubat la
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
Se amestecă la vortex și se lasă la incubat la 4 °C timp de 30-60 minute. 5.1.4. Se pune la centrifugat timp de 8 minute la 7 000 g, se elimină lichidul supernatant și se repune în suspensie extractul concentrat în 75 μl de tampon fosfatat la 0,01 M. 5.1.5. Se depun 16 μl de suspensii fixate pe o lamă multitest, astfel cum se indică în figura 3. Pe fiecare lamă se aplică două probe diferite
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
celule pozitive din cauza contaminării tamponului sau în cazul în care celulele pozitive sunt izolate (în exteriorul ferestrelor) pe mediul de montare al lamei. 5.3.4. Există un anumit număr de probleme inerente specificității testului FISH. Este posibil ca în extractele de conuri de stoloni și de segmente de tulpini de cartofi să apară populații nedorite de celule fluorescente morfologic atipice și de bacterii saprofite care provoacă reacții încrucișate și au mărimea și morfologia asemănătoare cu C. m. ssp. sepedonicus. Fenomenul
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
și la nici un martor negativ. În cazul în care proba conține celule care prezintă o fluorescență vie și o morfologie caracteristică, se evaluează numărul mediu de celule caracteristice pe câmp microscopic și se calculează numărul celulelor respective pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie (a se vedea apendicele 4). Probele care conțin cel puțin 5 x 103 celule caracteristice pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie sunt considerate ca fiind potențial contaminate. Trebuie continuate testele. Eșantioanele care conțin mai
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
numărul mediu de celule caracteristice pe câmp microscopic și se calculează numărul celulelor respective pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie (a se vedea apendicele 4). Probele care conțin cel puțin 5 x 103 celule caracteristice pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie sunt considerate ca fiind potențial contaminate. Trebuie continuate testele. Eșantioanele care conțin mai puțin de 5 x 103 celule caracteristice pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie sunt considerate ca fiind negative; (ii) testul FISH
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
care conțin cel puțin 5 x 103 celule caracteristice pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie sunt considerate ca fiind potențial contaminate. Trebuie continuate testele. Eșantioanele care conțin mai puțin de 5 x 103 celule caracteristice pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie sunt considerate ca fiind negative; (ii) testul FISH este negativ în cazul în care nu se observă, prin intermediul filtrului rodamină, celule de mărimea și cu morfologia caracteristice pentru C. m. ssp. sepedonicus care prezintă o fluorescență
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
de depistare principal nu se recomandă decât în cazul în care există o expertiză specializată în domeniu. Nota bene: Tetele preliminarii efectuate în conformitate cu această metodă trebuie să permită detectarea reproductibilă a 103-104 celule/ml de C. m. ssp. sepedonicus adăugate extractelor de probe care au dat anterior rezultate negative. Se pot dovedi necesare experiențe de optimizare pentru a obține niveluri maxime de sensibilitate și de specificitate în toate laboratoarele. Se folosesc reactivi și protocoale PCR validate. Se alege, de preferință, o
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
de biologie moleculară specializate. Martorii negativi (în ceea ce privește procedurile PCR și de extragere a ADN-ului) trebuie tratați întotdeauna ca probe finale în procedură, pentru a evidenția apariția unui eventual transfer de ADN. În testul PCR trebuie incluși următorii martori negativi: - extract de probă care a dat anterior rezultate negative pentru C. m. ssp. sepedonicus; - tampoane martori folosite pentru a extrage bacteria și ADN-ul din probă; - amestec reactiv pentru PCR. De asemenea, trebuie incluși aici și următorii martori pozitivi: - alicote de
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
de probă care a dat anterior rezultate negative pentru C. m. ssp. sepedonicus; - tampoane martori folosite pentru a extrage bacteria și ADN-ul din probă; - amestec reactiv pentru PCR. De asemenea, trebuie incluși aici și următorii martori pozitivi: - alicote de extracte finale repuse în suspensie, după ce s-a adăugat C. m. ssp. sepedonicus (a se vedea apendicele 2 pentru preparare); - suspensie în mediu apos de 106 celule pe mililitru dintr-un izolat virulent de C. m. ssp. sepedonicus (de exemplu, NCPPB
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
posibil, pentru testul PCR se utilizează ADN extras din probe de martori pozitivi. Pentru a evita riscurile de contaminare, martorii pozitivi se prepară într-un mediu diferit de cel în care se găsesc probele care trebuie testate. În măsura posibilului, extractele de probe trebuie curățate de pământ. În anumite cazuri, este recomandabil să se prepare extracte de cartofi spălați, în cazul în care se prevede folosirea protocoalelor PCR. 6.1. Metode de purificare a ADN-ului Se folosesc probe martori pozitivi
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
evita riscurile de contaminare, martorii pozitivi se prepară într-un mediu diferit de cel în care se găsesc probele care trebuie testate. În măsura posibilului, extractele de probe trebuie curățate de pământ. În anumite cazuri, este recomandabil să se prepare extracte de cartofi spălați, în cazul în care se prevede folosirea protocoalelor PCR. 6.1. Metode de purificare a ADN-ului Se folosesc probe martori pozitivi și negativi, în conformitate cu metoda descrisă anterior. Materialul de control se prepară la fel ca și
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
se prepară la fel ca și probele. Există o serie întreagă de metode pentru purificarea ADN-ului țintă, în cazul substratelor de probe complexe, pentru a elimina inhibitorii PCR și alte reacții enzimatice și a concentra ADN-ul țintă în extractul de probă. Următoarea metodă a fost optimizată pentru a fi utilizată cu metoda PCR validată, descrisă de apendicele 6. 6.1. (a) Metoda Pastrik (2000) 1. Se pun cu pipeta 220 μl de tampon de liză (100 mM NaCl, 10mM
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
2000) 1. Se pun cu pipeta 220 μl de tampon de liză (100 mM NaCl, 10mM Tri-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0] într-un tub Eppendorf de 1,5 ml. 2. Se adaugă 100 μl de extract de probă și se așază într-un bloc de încălzire sau într-o baie de aburi la 95 °C timp de zece minute. 3. Se așază tubul pe gheață timp de cinci minute. 4. Se adaugă 80 μl de soluție
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]