9,135 matches
-
la 100 % (-20 °C), se omogenizează rapid prin agitare și se lasă la incubat pe gheață timp de 10 minute. 11. Se centrifughează la 15 000 g timp de 20 de minute la 4 °C și se elimină etanolul din extractul concentrat. 12. Se adaugă 500 μl de etanol la 80 % (-20 ° C) și se amestecă, răsturnând tubul. 13. Se centrifughează la 15 000 g timp de 10 minute la 4 °C, se conservă extractul concentrat și se elimină etanolul. 14
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
C și se elimină etanolul din extractul concentrat. 12. Se adaugă 500 μl de etanol la 80 % (-20 ° C) și se amestecă, răsturnând tubul. 13. Se centrifughează la 15 000 g timp de 10 minute la 4 °C, se conservă extractul concentrat și se elimină etanolul. 14. Se lasă să se usuce extractul în aer liber sau într-un Speed Vac de ADN. 15. Se repune în suspensie extractul în concentrat în 100 μl de apă ultrapură sterilă și se lasă
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
μl de etanol la 80 % (-20 ° C) și se amestecă, răsturnând tubul. 13. Se centrifughează la 15 000 g timp de 10 minute la 4 °C, se conservă extractul concentrat și se elimină etanolul. 14. Se lasă să se usuce extractul în aer liber sau într-un Speed Vac de ADN. 15. Se repune în suspensie extractul în concentrat în 100 μl de apă ultrapură sterilă și se lasă la temperatura mediului înconjurător timp de cel puțin 20 de minute. 16
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
15 000 g timp de 10 minute la 4 °C, se conservă extractul concentrat și se elimină etanolul. 14. Se lasă să se usuce extractul în aer liber sau într-un Speed Vac de ADN. 15. Se repune în suspensie extractul în concentrat în 100 μl de apă ultrapură sterilă și se lasă la temperatura mediului înconjurător timp de cel puțin 20 de minute. 16. Se conservă la -20 °C până atunci când se utilizează pentru PCR. 17. Se izolează orice precipitat
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
între 103 și 104 celule de agent patogen pe mililitru. 6.2. PCR 6.2.1. Se prepară matricele de test și de control pentru PCR, urmând protocoalele validate (a se vedea apendicele 6). Se prepară o diluție zecimală din extractul de ADN provenit din probă (1:10 în apă ultrapură). 6.2.2. Se prepară amestecul reactiv pentru PCR într-un mediu lipsit de orice contaminare, în conformitate cu protocoalele publicate (a se vedea apendicele 6). Protocolul PCR validat este o reacție
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
reactiv pentru PCR într-un mediu lipsit de orice contaminare, în conformitate cu protocoalele publicate (a se vedea apendicele 6). Protocolul PCR validat este o reacție multiplex care include și un control PCR intern. 6.2.3. Se adaugă 5 μl de extract de ADN la 25 μl reactiv PCR, în tuburi PCR sterile. 6.2.4. Se constituie o probă martor negativ care nu conține decât amestecul reactiv pentru PCR și se adaugă în locul probei o apă pură provenind din aceeași sursă
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
bene: Se poate suspecta o inhibiție a PCR, în cazul în care amplimerul preconizat se obține pe baza probei martor pozitiv care conține C. m. ssp. sepedonicus în soluție apoasă, atunci când martorii pozitivi care conțin C. m. ssp. sepedonicus în extractul de cartof dau un rezultat negativ. În protocoalele PCR multiplex cu controale PCR interne inhibiția reacției este probabilă atunci când nu se obține nici unul dintre cei doi amplimeri. Se poate suspecta o contaminare, în cazul în care amplimerul preconizat este evidențiat
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
preconizat este evidențiat în cel puțin unul dintre martorii negativi. 7. TESTUL BIOLOGIC Nota bene: Testele preliminarii realizate în conformitate cu această metodă trebuie să permită detectarea reproductibilă a 103-104 celule/ml de C. m. ssp. sepedonicus care să formeze colonii, adăugate extractelor de probe care anterior au dat rezultate negative (pentru preparare, a se vedea apendicele 2). Pentru a obține o sensibilitate maximă a detecției este preferabil să se utilizeze un extract de probă proaspăt preparat în condiții optime de creștere. Cu
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
de C. m. ssp. sepedonicus care să formeze colonii, adăugate extractelor de probe care anterior au dat rezultate negative (pentru preparare, a se vedea apendicele 2). Pentru a obține o sensibilitate maximă a detecției este preferabil să se utilizeze un extract de probă proaspăt preparat în condiții optime de creștere. Cu toate acestea, metoda poate fi aplicată cu succes pentru extracte conservate în soluție de glicerol la temperaturi între -68 °C și -86 °C. Anumite varietăți de pătlăgea vânătă constituie un
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
preparare, a se vedea apendicele 2). Pentru a obține o sensibilitate maximă a detecției este preferabil să se utilizeze un extract de probă proaspăt preparat în condiții optime de creștere. Cu toate acestea, metoda poate fi aplicată cu succes pentru extracte conservate în soluție de glicerol la temperaturi între -68 °C și -86 °C. Anumite varietăți de pătlăgea vânătă constituie un mediu excelent de îmbogățire selectivă pentru cultura de C. m. ssp. sepedonicus, chiar și în absența simptomelor și permit, de
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
trebuie să fie optime. Pentru detaliile privind cultura, a se vedea apendicele 8. 7.1. Se repartizează pe pătlăgelele vinete, în conformitate cu una dintre metodele indicate în continuare (punctul 7.3 sau 7.4), tot restul de alicotă de test din extractul concentrat repus în suspensie, obținut în conformitate cu indicațiile din secțiunea 3.1.6 sau 3.2.5. Se folosesc doar plante ajunse în stadiul celei de-a doua sau a treia frunze, până la dezvoltarea completă a celei de-a treia frunze
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
în conformitate cu indicațiile din secțiunea 3.1.6 sau 3.2.5. Se folosesc doar plante ajunse în stadiul celei de-a doua sau a treia frunze, până la dezvoltarea completă a celei de-a treia frunze adevărate. Pentru a folosi integral extractul concentrat repus în suspensie și pentru a asigura eficacitatea inoculării, sunt necesare între 15 și 25 de pătlăgele vinete pe eșantion pentru efectuarea procedurilor descrise în continuare. 7.2. Înainte de inoculare, pătlăgelele vinete nu trebuie udate timp de una sau
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
zile pentru a reduce presiunea turgescenței. 7.3. Inoculare prin incizie. 7.3.1. Se ține planta între două degete și se pune cu pipeta pe tulpină, între cotiledoane și prima frunză, o picătură (în jur de 5-10 μl) de extract concentrat în suspensie. 7.3.2. Cu ajutorul unui scalpel steril se practică, plecând de la picătura de extract concentrat, o incizie diagonală cu o lungime de 1,0 cm și o adâncime aproximativ egală cu două treimi din grosimea tulpinii. 7
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
între două degete și se pune cu pipeta pe tulpină, între cotiledoane și prima frunză, o picătură (în jur de 5-10 μl) de extract concentrat în suspensie. 7.3.2. Cu ajutorul unui scalpel steril se practică, plecând de la picătura de extract concentrat, o incizie diagonală cu o lungime de 1,0 cm și o adâncime aproximativ egală cu două treimi din grosimea tulpinii. 7.3.3. Se închide incizia cu vaselină sterilă, folosind o seringă. 7.4. Inoculare prin injecție Inocularea
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
aceeași metodă (a se vedea punctul 7.3 sau 7.4) cu o suspensie apoasă care conține între 105 și 106 celule/ml dintr-o cultură cunoscută de C. m. ssp. sepedonicus și, în cazul în care este posibil, cu extract din tubercul infectat în mod natural (a se vedea secțiunea 4). 7.6. Ca martori negativi, se inoculează cinci plante prin aceeași metodă (a se vedea punctul 7.3 sau 7.4) cu o soluție tampon sterilă de extract concentrat
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
cu extract din tubercul infectat în mod natural (a se vedea secțiunea 4). 7.6. Ca martori negativi, se inoculează cinci plante prin aceeași metodă (a se vedea punctul 7.3 sau 7.4) cu o soluție tampon sterilă de extract concentrat. 7.7. Se lasă plantele la incubat până la patru săptămâni la temperaturi între 18 °C și 24 °C, în spații adaptate la condițiile de carantină. În timpul incubației se menține o lumină suficientă și un grad ridicat de umiditate (de la
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
sepedonicus decât plantele mai în vârstă, de unde necesitatea de a utiliza plante în stadiul celei de-a treia frunze sau chiar înaintea acestui stadiu. Veștejirile mai pot fi provocate și de populații de alte bacterii sau de ciuperci prezente în extractul concentrat de țesut tubercular. Este vorba, printre altele, de Ralstonia solanacearum, de Erwinia carotovora ssp. carotovora și de E. carotovora ssp. atroseptica, de Erwinia chrysanthemi, de Phoma exigua var. foveata, precum și de vaste populații de bacterii saprofite. Erwinia chrysanthemi, în
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
un organism dificil de izolat, izolarea este posibilă pe baza țesutului care prezintă simptome de infecție. Cu toate acestea, organismul poate fi sufocat de bacterii saprofite cu creștere rapidă, ceea ce îl face dificil de izolat în mod direct pe baza extractului concentrat de țesut de tubercul sau de tulpină (obținut la secțiunea 3.1.6 sau 3.2.5). Izolarea directă a C. m. ssp. sepedonicus rămâne posibilă pe mediu selectiv și pe baza unei diluții adecvate de extract concentrat, repus
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
pe baza extractului concentrat de țesut de tubercul sau de tulpină (obținut la secțiunea 3.1.6 sau 3.2.5). Izolarea directă a C. m. ssp. sepedonicus rămâne posibilă pe mediu selectiv și pe baza unei diluții adecvate de extract concentrat, repus în suspensie, de conuri de cartofi prelevate de la stolonul sau tulpina de cartof. Izolările trebuie practicate pe toți tuberculii sau pe toate segmentele de tulpini de cartofi și pe toate pătlăgelele vinete care nu prezintă nici un simptom, dar
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
agentului patogen înainte de a-l utiliza pentru testarea probelor de rutină. Materialul de control se testează la fel ca și probele. 8.1. Desfășurare pe medii selective 8.1.1. Pe baza a 100 μl de alicotă de probă de extract concentrat de cartof repus în suspensie sau de sevă de pătlăgea vânătă, se efectuează diluții la a zecea parte într-un tampon de extract concentrat (a se vedea apendicele 3). 8.1.2. Tentativele de izolare pe bază de extract
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
pe medii selective 8.1.1. Pe baza a 100 μl de alicotă de probă de extract concentrat de cartof repus în suspensie sau de sevă de pătlăgea vânătă, se efectuează diluții la a zecea parte într-un tampon de extract concentrat (a se vedea apendicele 3). 8.1.2. Tentativele de izolare pe bază de extract concentrat nediluat de cartof se soldează, în general, cu eșecuri datorită dificultăților pe care le prezintă cultura de Cms și a concurenței saprofitelor. Deoarece
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
extract concentrat de cartof repus în suspensie sau de sevă de pătlăgea vânătă, se efectuează diluții la a zecea parte într-un tampon de extract concentrat (a se vedea apendicele 3). 8.1.2. Tentativele de izolare pe bază de extract concentrat nediluat de cartof se soldează, în general, cu eșecuri datorită dificultăților pe care le prezintă cultura de Cms și a concurenței saprofitelor. Deoarece bacteria este în general prezentă în masă în țesuturile infectate, cel mai adesea este posibil să
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
de hockey"), 100 μl din fiecare probă, cu diluții de 1/100-1/10 000, pe un mediu MTNA sau NCP-88 (a se vedea apendicele 5). Nota bene: O altă strategie poate consta în desfășurarea alicotei inițiale de 100 μl de extract concentrat de cartof pe o primă lamă de agar cu ajutorul unui aplicator, întinderea în striuri pe o a doua lamă a restului rămas pe aplicator și repetarea procedurii pe o a treia lamă. Aplicatorul permite astfel ca pe lame să
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
efectuează o însămânțare în striuri a coloniilor cu aspect asemănător cu C. m. ssp. sepedonicus, pe unul dintre următoarele medii (formulele figurează în apendicele 5): agar nutritiv cu dextroză (numai pentru repicări); agar cu drojdie, peptonă și glucoză; agar cu extract de drojdie și săruri minerale. Se lasă la incubat până la 10 zile la o temperatură cuprinsă între 21 °C și 24 °C. C. m. ssp. sepedonicus se multiplică lent și produce, în general în zece zile, colonii de dimensiunea și
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
0,20-600 nm. Se prelevează un con de stolon de la 200 de tuberculi dintr-o recoltă de varietate cu coajă albă, cunoscută ca fiind lipsită de C. m. ssp. sepedonicus. solanacearum. Se tratează stolonii urmând metoda obișnuită și se repune extractul concentrat în suspensie de 10 mililitri. Se varsă 900 μl de extract concentrat repus în suspensie în zece microfiole sterile de 1,5 ml. Se însămânțează prima microfiolă cu 100 μl din suspensia de C. m. ssp. sepedonicus. Se omogenizează
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]