1,026 matches
-
se efectuează cu ajutorul unei tehnici corespunzătoare prin diluare și însămânțare cu scopul de a asigura diluarea întregii populații care formează colonii de saprofite. Se folosesc 50-100 μl din fiecare eșantion de extract și fiecare diluție. 4.1.2. Plăcile se incubează la 28 °C. Citirea plăcilor se face după 48 ore, iar apoi zilnic pe o perioadă de până la șase zile. Coloniile tipice de R. solanacearum în mediul nutritiv SMSA sunt de culoare alb-lăptos, plate, neregulate și fluide, iar după trei
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
anterior în tuburi sau flacoane fără urme de ADN. Pentru îmbogățirea ELISA, se pot folosi proporții mai mari de mediu nutritiv lichid (de exemplu, 100 μl în 1,0 ml de mediu nutritiv lichid de îmbogățire). 4.2.2. Se incubează timp de 72 ore între 27 și 30 °C într-o cultură agitată sau statică fără a închide ermetic dopul tubului, pentru a permite aerisirea. 4.2.3. Se amestecă bine înainte de a se utiliza pentru testele ELISA sau PCR
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
diluția sau diluțiile de anticorpi. Cantitatea de antiser aplicat în fiecare fereastră trebuie să fie cel puțin echivalentă cu cantitatea de extract aplicată. Următoarea procedură ar trebui aplicată în absența instrucțiunilor specifice ale furnizorilor de anticorpi: 5.3.2. Se incubează lamele pe hârtie umedă acoperite timp de 30 de minute la temperatura ambiantă (18-25 °C). 5.3.3. Se scutură picăturile de antiser de pe fiecare lamă și se clătesc lamele cu atenție cu un tampon pentru imunofluorescență. Se spală timp
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
5.3.4. Se așază lamele pe hârtie umedă. Se acoperă ferestrele de test cu diluția conjugatului FITC utilizat pentru determinarea titrării. Cantitatea conjugatului aplicată în ferestre trebuie să fie echivalentă cu cantitatea de anticorpi utilizată. 5.3.5. Se incubează lamele pe hârtie umedă, acoperite timp de treizeci de minute la temperatura ambiantă (18-25 °C). 5.3.6. Se scutură picăturile de conjugat de pe lamă. Se clătesc și se spală în conformitate cu cele indicate anterior (5.3.3). Se îndepărtează cu
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
C timp de zece minute. (3) Se așază tubul pe gheață timp de cinci minute. (4) Se adaugă 80 μl de soluție concentrată de lizozimă (50 mg de lizozimă pe ml în 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) și se incubează la 37 °C timp de 30 de minute. (5) Se adaugă 220 μl de soluție A de Easy DNA(r) (Invitrogen), se amestecă bine în agitator și se incubează la 65 °C timp de 30 de minute. (6) Se adaugă
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
pe ml în 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) și se incubează la 37 °C timp de 30 de minute. (5) Se adaugă 220 μl de soluție A de Easy DNA(r) (Invitrogen), se amestecă bine în agitator și se incubează la 65 °C timp de 30 de minute. (6) Se adaugă 100 μl de soluție B de Easy DNA(r) (Invitrogen), se omogenizează bine în agitator până când precipitatul circulă liber în tub, iar eșantionul are o consistență vâscoasă uniformă. (7
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
minute la 4 °C pentru a separa fazele și a forma interfaza. (9) Faza superioară se transferă într-un nou tub Eppendorf. (10) Se adaugă 1 ml de etanol la 100 % (- 20 °C), se omogenizează scurt în agitator și se incubează pe gheață timp de zece minute. (11) Se centrifughează la 15 000 g timp de 20 de minute la 4 °C și se îndepărtează etanolul din extractul concentrat. (12) Se adaugă 500 μl de etanol la 80 % (- 20 °C) și
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
cu unde scurte (λ = 302 nm) și se notează rezultatele. 6.3.4. Pentru noile cazuri sau constatări, se verifică autenticitatea fragmentului amplificat PCR efectuând o analiză enzimatică restrictivă pe un eșantion al ADN amplificat rămas. În acest scop, se incubează la o temperatură optimă pe o durată optimă folosind o enzimă și un tampon corespunzător (a se vedea apendicele 6). Fragmentele digerate prin electroforeză în gel de agar se detectează în conformitate cu metoda descrisă anterior și se vizualizează prin iluminare ultravioletă
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
se centrifughează timp de șapte minute la 7 000 g. 7.1.3. Se îndepărtează supranatantul și se dizolvă extractul concentrat în 200 μl de fixativ preparat cu mai puțin de 24 ore înainte. Se omogenizează în agitator și se incubează timp de o oră în frigider. 7.1.4. Se centrifughează timp de șapte minute la 7 000 g, se îndepărtează supranatantul și se face o nouă suspensie de extract concentrat în 75 μl de PB 0,01 M (a
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
2) Se adaugă un volum egal de tampon dublu concentrat (apendicele 4) și se omogenizează în agitator. (3) Se aplică 100 μl alicote în fiecare dintre minimum două godeuri ale plăcii de microtitrare (de exemplu, Nunc-Polysorp sau echivalent) și se incubează o oră la 37 °C sau peste noapte la 4 °C. (4) Se scot extractele din godeuri. Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4), lăsând ultima soluție de spălare cel puțin cinci minute în godeuri. (5) Se
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
prepară diluția corespunzătoare a antiserului anti-R. solanacearum în tampon de saturație (apendicele 4). Pentru anticorpii comerciali validați, se folosesc diluțiile recomandate (de obicei, de două ori mai concentrate decât titrul). (6) Se aplică 100 μl în fiecare godeu și se incubează o oră la 37 °C. (7) Se scoate soluția de anticorpi din godeuri și se spală în conformitate cu cele indicate anterior (punctul 4). (8) Se prepară diluția corespunzătoare de conjugați secundari de anticorpi și de fosfatază alcalină în tampon de saturație
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
de anticorpi din godeuri și se spală în conformitate cu cele indicate anterior (punctul 4). (8) Se prepară diluția corespunzătoare de conjugați secundari de anticorpi și de fosfatază alcalină în tampon de saturație. Se adaugă 100 μl în fiecare godeu și se incubează o oră la 37 °C. (9) Se scoate conjugatul de anticorpi din godeuri și se spală în conformitate cu cele indicate anterior (punctul 4). (10) Se adaugă 100 μl de soluție de substrat de fosfatază alcalină (apendicele 4) în fiecare godeu. Se
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
o oră la 37 °C. (9) Se scoate conjugatul de anticorpi din godeuri și se spală în conformitate cu cele indicate anterior (punctul 4). (10) Se adaugă 100 μl de soluție de substrat de fosfatază alcalină (apendicele 4) în fiecare godeu. Se incubează în întuneric la temperatura ambiantă și se măsoară absorbanța la 405 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute. (b) DAS-ELISA (1) Se prepară diluția corespunzătoare de imunoglobuline policlonale anti-R. solanacearum în tampon concentrat cu pH 9,6
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
405 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute. (b) DAS-ELISA (1) Se prepară diluția corespunzătoare de imunoglobuline policlonale anti-R. solanacearum în tampon concentrat cu pH 9,6 (apendicele 4). Se adaugă 200 μl în fiecare godeu. Se incubează timp de patru-cinci ore la 37 °C sau timp de 16 ore la 4 °C. (2) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). Se adaugă 190 μl de extract de eșantion în cel puțin două godeuri. De
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). Se adaugă 190 μl de extract de eșantion în cel puțin două godeuri. De asemenea, se adaugă eșantioane de control pozitiv și negativ în două godeuri pe fiecare placă. Se incubează timp de șaisprezece ore la 4 °C. (3) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (4) Se prepară o diluție corespunzătoare de anticorpi monoclonali specifici R. solanacearum în PBS (apendicele 4) conținând, de asemenea, 0,5 % seralbumină
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (4) Se prepară o diluție corespunzătoare de anticorpi monoclonali specifici R. solanacearum în PBS (apendicele 4) conținând, de asemenea, 0,5 % seralbumină bovină (BSA) și se adaugă 190 μl în fiecare godeu. Se incubează două ore la 37 °C. (5) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (6) Se prepară o diluție corespunzătoare de imunoglobuline antișoarece conjugate cu fosfatază alcalină în PBS. Se adaugă 190 μl în fiecare godeu. Se incubează
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
incubează două ore la 37 °C. (5) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (6) Se prepară o diluție corespunzătoare de imunoglobuline antișoarece conjugate cu fosfatază alcalină în PBS. Se adaugă 190 μl în fiecare godeu. Se incubează două ore la 37 °C. (7) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (8) Se prepară o soluție de substrat al fosfatazei alcaline conținând 1 mg de p-nitrofenil fosfat pe ml de substanță tamponată (apendicele 4). Se
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (8) Se prepară o soluție de substrat al fosfatazei alcaline conținând 1 mg de p-nitrofenil fosfat pe ml de substanță tamponată (apendicele 4). Se adaugă 200 μl în fiecare godeu. Se incubează în întuneric la temperatura ambiantă și se măsoară absorbanța la 40 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute. Interpretarea rezultatelor testelor ELISA Testul ELISA este negativ atunci când densitatea optică (DO) medie a godeurilor eșantionului dublu este mai
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
de carantină până la patru săptămâni la 25-30 °C și umiditate relativă mare, stropindu-le în mod corespunzător pentru a preveni o suprasaturare hidrică sau ofilirea din lipsă de apă. Pentru a evita contaminarea, plantele de control pozitiv și negativ se incubează separat în standuri separate în mod corespunzător într-o seră sau cameră de cultivare sau, în cazul în care spațiul este limitat, se asigură o separare strictă între metodele de tratare. Atunci când plantele aparținând unor eșantioane diferite trebuie incubate în
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
se incubează separat în standuri separate în mod corespunzător într-o seră sau cameră de cultivare sau, în cazul în care spațiul este limitat, se asigură o separare strictă între metodele de tratare. Atunci când plantele aparținând unor eșantioane diferite trebuie incubate în apropiere unele de celelalte, trebuie prevăzute între ele ecrane de separare corespunzătoare. În timpul fertilizării, stropirii, controlului sau oricărei alte manipulări, trebuie luate toate măsurile de precauție pentru a evita o contaminare încrucișată. Este esențial ca în serele și camerele
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
de exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; a se vedea apendicele 3). (2) Se inoculează 5-10 plantule de tomată sau vânătă sensibile, la nivelul celei de a treia frunze adevărate (a se vedea secțiunea VI.A.9). (3) Se incubează până la două săptămâni la 25-28 °C și într-o umiditate relativă crescută, asigurând o stropire corespunzătoare pentru a preveni suprasaturarea hidrică sau stresul de deshidratare. În cazul culturilor pure, în 15 zile ar trebui să intervină ofilirea. În absența simptomelor
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
inoculării. Se mărunțește și se suspendă într-un volum mic de apă distilată sterilă sau cu un tampon fosfat de 50 mM (apendicele 4). Se izolează suspensia prin diluare într-un mediu adecvat, de preferință mediu selectiv (apendicele 2), se incubează timp de 48-72 ore la 28 °C și se observă formarea coloniilor tipice de R. solanacearum. Apendicele 1 Laboratoarele care efectuează optimizarea și validarea protocoalelor ***[PLEASE INSERT TEXT FROM ORIGINAL IN THE FIRST COLUMN]*** Laborator 1 Loc Țara Viena și
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
enzimă care distruge receptorul, pentru a evita fenomenul menționat. Trebuie folosită următoarea metodă: (a) se adaugă 400 μl enzimă pentru distrugerea receptorului (diluție de lucru predeterminată) la 100 μl antiser de porc și se amestecă atent; (b) se lasă la incubat la 37 °C timp de o oră; (c) se lasă apoi la incubat timp de treizeci de minute la 56 °C; (d) eșantioanele se lasă să se răcească la 4 °C timp de cel puțin cincisprezece minute; (e) se adaugă
32006D0437-ro () [Corola-website/Law/294831_a_296160]
-
d) eșantioanele se lasă să se răcească la 4 °C timp de cel puțin cincisprezece minute; (e) se adaugă 10 μl globule roșii de pui la 30 % (v/v de concentrat globular) și se amestecă energic; (f) se lasă la incubat la 4 °C până a doua zi. În cazul în care eșantioanele trebuie folosite neapărat în aceeași zi, se lasă la incubat la 37 °C timp de o oră și se centrifughează la 300 x g timp de cinci minute
32006D0437-ro () [Corola-website/Law/294831_a_296160]
-
roșii de pui la 30 % (v/v de concentrat globular) și se amestecă energic; (f) se lasă la incubat la 4 °C până a doua zi. În cazul în care eșantioanele trebuie folosite neapărat în aceeași zi, se lasă la incubat la 37 °C timp de o oră și se centrifughează la 300 x g timp de cinci minute. Serul tratat astfel poate fi folosit în testele IH la fel ca pentru serurile de păsări, în conformitate cu alineatul [...], diluția inițială fiind de
32006D0437-ro () [Corola-website/Law/294831_a_296160]