689 matches
-
lungimi de undă. Spectrul de excitație al fluorescenței reprezintă dependența intensității relative a excitației în funcție de lungimea de undă, atunci când lungimea de undă de emisie rămâne constantă, arătând eficiența relativă a diferitelor lungimi de undă de a produce fluorescență. Experimentele de fluorescență aduc informații cu privire la caracteristicile spectrale ale unor molecule: intensitatea de emisie fluorescentă, lungimea de undă a maximului de emisie, timpul de viață a fluorescenței, randamentul cuantic, deplasarea Stokes, anizotropia fluorescenței. Există o serie de factori, de natură diferită, care afectează
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
rămâne constantă, arătând eficiența relativă a diferitelor lungimi de undă de a produce fluorescență. Experimentele de fluorescență aduc informații cu privire la caracteristicile spectrale ale unor molecule: intensitatea de emisie fluorescentă, lungimea de undă a maximului de emisie, timpul de viață a fluorescenței, randamentul cuantic, deplasarea Stokes, anizotropia fluorescenței. Există o serie de factori, de natură diferită, care afectează spectrele de emisie fluorescentă a proteinelor aflate în soluții, maximul de emisie depinzând de acești factori. De exemplu, deplasarea maximului de emisie fluorescentă se
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
diferitelor lungimi de undă de a produce fluorescență. Experimentele de fluorescență aduc informații cu privire la caracteristicile spectrale ale unor molecule: intensitatea de emisie fluorescentă, lungimea de undă a maximului de emisie, timpul de viață a fluorescenței, randamentul cuantic, deplasarea Stokes, anizotropia fluorescenței. Există o serie de factori, de natură diferită, care afectează spectrele de emisie fluorescentă a proteinelor aflate în soluții, maximul de emisie depinzând de acești factori. De exemplu, deplasarea maximului de emisie fluorescentă se datorează unor modificări apărute în solvent
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
de acești factori. De exemplu, deplasarea maximului de emisie fluorescentă se datorează unor modificări apărute în solvent: redistribuirea electronilor în solvent, reorientarea moleculelor de solvent în jurul dipolilor stării excitate sau interacțiunea dintre fluorofori și solvent. Influența solventului asupra spectrelor de fluorescență se traduce în informații despre mișcarea moleculelor, localizarea fluoroforilor legați de molecula respectivă sau de membrane. Spectrele de emisie fluorescentă sunt influențate și de transferul de energie, pH, temperatură și diverși detergenți. Temperatura este unul dintre factorii care afectează foarte
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
va fi utilizată pentru obținerea unei probe cu concentrația de HSA de 2 µM. Masa moleculară a proteinei HSA este de 66439 Da. 2. Modul de lucru Se va urmări denaturarea termică a HSA prin înregistrarea spectrelor de emisie a fluorescenței proteinei, între 25 oC și 85 oC, intervalul de creștere fiind de 5 oC. Înainte de înregistrarea spectrelor de emisie, proba va fi lăsată în cuvă, timp de 5 minute, pentru a ajunge la temperatura dorită. Temperatura probei va fi monitorizată
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
ajunge la temperatura dorită. Temperatura probei va fi monitorizată utilizând un dispozitiv de termostatare. După prepararea probelor, se vor seta parametrii experimentali, utilizând soft-ul spectrofluorimetrului Perkin Elmer LS55. Astfel: se va accesa aplicația pentru înregistrarea spectrelor de emisie a fluorescenței; se va fixa lungimea de undă de excitație la 295 nm (pentru a minimiza excitarea tirozinelor din structura proteinei HSA) și se va culege informația spectrală pe intervalul, 300 nm 600 nm; se va seta sistemul de fante ale monocromatoarelor
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
a temperaturii setate pe unitatea de termostatare (între 25 oC și 85 oC), așteptând un timp de 5 minute, pentru ca în compartimentul cuvei să fie atinsă temperatura de lucru; se va urmări renaturarea proteinei, prin trasarea spectrelor de emisie a fluorescenței HSA, între 85 oC și 25 oC.. Se vor reprezenta grafic dependențele maximelor intensităților de emisie fluorescentă, pentru cele două procese termice, denaturare și renaturare, în funcție de temperatură, la aceeași lungime de undă (corespunzătoare maximului emisiei fluorescente de la prima înregistrare).. Se
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
datele din literatura de specialitate, referitoare la alte albumine serice (albumina serică bovină, ovalbumina). Studiul spectrofotofluorimetric al interacțiunii proteinelor cu liganzi specifici Considerații teoretice Diagrama Jablonski, prezentată în lucrarea Evidențierea procesului de denaturare termică a proteinelor, folosind metoda spectroscopiei de fluorescență, prezintă nivelurile energetice și schimbul de energie, radiativ și neradiativ, dintre acestea: absorbția unor fotoni, de pe starea electronică fundamentală, pe stări electronice excitate; emisia fluorescentă a unor fotoni, de pe starea electronică excitată singlet, S1, pe starea electronică fundamentală; emisia fosforescentă
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
a unor fotoni, de pe o stare triplet, T, excitată, pe starea fundamentală; transferul energetic încrucișat (CIS), între starea singlet și starea triplet; transferul neradiativ de energie (conversia internă: CI), între stări singlet și între o stare singlet și una triplet. Fluorescența este un fenomen fizic, care are două faze distincte: excitarea moleculelor pe niveluri electronice superioare și emisia de radiație de către acestea, de pe primul nivel electronic singlet excitat pe nivelul fundamental. Cromoforii fluorescenți (denumiți și fluorofori) absorb fotoni, rămân în stare
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
acestea, de pe primul nivel electronic singlet excitat pe nivelul fundamental. Cromoforii fluorescenți (denumiți și fluorofori) absorb fotoni, rămân în stare excitată câteva nanosecunde, după care emit, de regulă, fotoni de energie mai mică. Foarte multe molecule de interes biologic prezintă fluorescență intrinsecă, datorată grupărilor de tip cromofor pe care le posedă. Fluorescența intrinsecă a proteinelor. Doar trei dintre aminoacizii din care se formează lanțurile proteinelor prezintă fluorescență intrinsecă: triptofanul (Trp), tirozina (Tyr) și fenilalanina (Phe). Pentru fiecare dintre acești aminoacizi aromatici
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
fluorescenți (denumiți și fluorofori) absorb fotoni, rămân în stare excitată câteva nanosecunde, după care emit, de regulă, fotoni de energie mai mică. Foarte multe molecule de interes biologic prezintă fluorescență intrinsecă, datorată grupărilor de tip cromofor pe care le posedă. Fluorescența intrinsecă a proteinelor. Doar trei dintre aminoacizii din care se formează lanțurile proteinelor prezintă fluorescență intrinsecă: triptofanul (Trp), tirozina (Tyr) și fenilalanina (Phe). Pentru fiecare dintre acești aminoacizi aromatici, fluorescența poate fi observată la lungimi de undă caracteristice, în funcție de solventul
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
de regulă, fotoni de energie mai mică. Foarte multe molecule de interes biologic prezintă fluorescență intrinsecă, datorată grupărilor de tip cromofor pe care le posedă. Fluorescența intrinsecă a proteinelor. Doar trei dintre aminoacizii din care se formează lanțurile proteinelor prezintă fluorescență intrinsecă: triptofanul (Trp), tirozina (Tyr) și fenilalanina (Phe). Pentru fiecare dintre acești aminoacizi aromatici, fluorescența poate fi observată la lungimi de undă caracteristice, în funcție de solventul în care se află. Triptofanul este cel mai important fluorofor din proteine, fiind responsabil de
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
intrinsecă, datorată grupărilor de tip cromofor pe care le posedă. Fluorescența intrinsecă a proteinelor. Doar trei dintre aminoacizii din care se formează lanțurile proteinelor prezintă fluorescență intrinsecă: triptofanul (Trp), tirozina (Tyr) și fenilalanina (Phe). Pentru fiecare dintre acești aminoacizi aromatici, fluorescența poate fi observată la lungimi de undă caracteristice, în funcție de solventul în care se află. Triptofanul este cel mai important fluorofor din proteine, fiind responsabil de aproximativ 90 % din fluorescența acestora. Fluorescența unei proteine împachetate, care are o structură spațială, este
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
tirozina (Tyr) și fenilalanina (Phe). Pentru fiecare dintre acești aminoacizi aromatici, fluorescența poate fi observată la lungimi de undă caracteristice, în funcție de solventul în care se află. Triptofanul este cel mai important fluorofor din proteine, fiind responsabil de aproximativ 90 % din fluorescența acestora. Fluorescența unei proteine împachetate, care are o structură spațială, este, însă, dată de contribuția fluorescenței tuturor aminoacizilor aromatici individuali, prezenți în lanțul polipeptidic. În comparație cu emisia Trp, emisia fluorescentă a Tyr este mai slabă, iar cea a Phe trece neobservată
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
și fenilalanina (Phe). Pentru fiecare dintre acești aminoacizi aromatici, fluorescența poate fi observată la lungimi de undă caracteristice, în funcție de solventul în care se află. Triptofanul este cel mai important fluorofor din proteine, fiind responsabil de aproximativ 90 % din fluorescența acestora. Fluorescența unei proteine împachetate, care are o structură spațială, este, însă, dată de contribuția fluorescenței tuturor aminoacizilor aromatici individuali, prezenți în lanțul polipeptidic. În comparație cu emisia Trp, emisia fluorescentă a Tyr este mai slabă, iar cea a Phe trece neobservată, fiind acoperită
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
lungimi de undă caracteristice, în funcție de solventul în care se află. Triptofanul este cel mai important fluorofor din proteine, fiind responsabil de aproximativ 90 % din fluorescența acestora. Fluorescența unei proteine împachetate, care are o structură spațială, este, însă, dată de contribuția fluorescenței tuturor aminoacizilor aromatici individuali, prezenți în lanțul polipeptidic. În comparație cu emisia Trp, emisia fluorescentă a Tyr este mai slabă, iar cea a Phe trece neobservată, fiind acoperită de semnalele Trp și/sau Tyr. De fapt, Phe ar trebui să fie excitată
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
precum denaturarea proteinelor (care se produce sub acțiunea anumitor factori fizico chimici), care au ca efect, în general, creșterea emisiei tirozinei. Acest fenomen se produce datorită transferului de energie de la Trp la Tyr. Sunt prezentate caracteristicile de absorbție și de fluorescență ale celor trei fluorofori naturali ai proteinelor, în apă. Poziționarea maximului de emisie a proteinelor față de cel al Trp liber furnizează o serie de informații legate de structura împachetată a proteinei, ca urmare a influenței mediului în care se găsește
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
prezintă absorbție maximă la 280 nm. Spectrul de emisie fluorescentă arată că intensitatea de emisie este maximă la aproximativ 340 nm. De asemenea, prin suprapunerea celor două spectre, este pusă în evidență deplasarea Stokes. Principalul motiv pentru care se studiază fluorescența intrinsecă a proteinelor este acela de a obține informații cu privire la conformația acestora, în diferite medii în care sunt dizolvate. Acest fapt este posibil, deoarece atât fluorescența Trp, cât și cea a Tyr depind, după cum s-a amintit, de o multitudine
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
două spectre, este pusă în evidență deplasarea Stokes. Principalul motiv pentru care se studiază fluorescența intrinsecă a proteinelor este acela de a obține informații cu privire la conformația acestora, în diferite medii în care sunt dizolvate. Acest fapt este posibil, deoarece atât fluorescența Trp, cât și cea a Tyr depind, după cum s-a amintit, de o multitudine de factori externi, precum temperatura, natura și proprietățile solventului, pH-ul soluției, prezența sau absența unor ioni/molecule în soluția de proteină sau acțiunea radiațiilor ionizante
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
depind, după cum s-a amintit, de o multitudine de factori externi, precum temperatura, natura și proprietățile solventului, pH-ul soluției, prezența sau absența unor ioni/molecule în soluția de proteină sau acțiunea radiațiilor ionizante. Unul dintre factorii importanți care influențează fluorescența proteinelor este polaritatea solventului. Poziția maximului emisiei fluorescente, așa cum se obține din spectrul de emisie, este sensibilă la polaritatea mediului și la mobilitatea fluoroforului în acest mediu. În general, starea excitată este mult mai polară decât cea fundamentală. În aceste
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
alinieri este reprezentată prin deplasarea spre lungimi de undă mai mari a maximului intensității relative de emisie (spre domeniul spectral roșu). Astfel, modificarea poziției maximului de emisie poate fi utilizată ca măsură a polarității mediului înconjurător al fluoroforilor. În cazul fluorescenței Trp, intensitatea fluorescenței la λmax crește când polaritatea solventului scade. Mai jos este prezentat modul în care se poate modifica spectrul de emisie fluorescentă a unei proteine, sub influența modificărilor condițiilor de mediu. Atunci când fluorescența naturală a proteinelor nu este
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
prin deplasarea spre lungimi de undă mai mari a maximului intensității relative de emisie (spre domeniul spectral roșu). Astfel, modificarea poziției maximului de emisie poate fi utilizată ca măsură a polarității mediului înconjurător al fluoroforilor. În cazul fluorescenței Trp, intensitatea fluorescenței la λmax crește când polaritatea solventului scade. Mai jos este prezentat modul în care se poate modifica spectrul de emisie fluorescentă a unei proteine, sub influența modificărilor condițiilor de mediu. Atunci când fluorescența naturală a proteinelor nu este suficientă, în anumite
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
înconjurător al fluoroforilor. În cazul fluorescenței Trp, intensitatea fluorescenței la λmax crește când polaritatea solventului scade. Mai jos este prezentat modul în care se poate modifica spectrul de emisie fluorescentă a unei proteine, sub influența modificărilor condițiilor de mediu. Atunci când fluorescența naturală a proteinelor nu este suficientă, în anumite experimente se folosesc fluorofori extrinseci, legați prin legături necovalente la proteine, pentru a îmbunătăți proprietățile fluorescente ale sistemului studiat. Fluorescența extrinsecă a proteinelor. Există situații în care fluorescența proteinelor poate fi indusă
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
emisie fluorescentă a unei proteine, sub influența modificărilor condițiilor de mediu. Atunci când fluorescența naturală a proteinelor nu este suficientă, în anumite experimente se folosesc fluorofori extrinseci, legați prin legături necovalente la proteine, pentru a îmbunătăți proprietățile fluorescente ale sistemului studiat. Fluorescența extrinsecă a proteinelor. Există situații în care fluorescența proteinelor poate fi indusă, pentru a fi studiate anumite caracteristici structurale, fie prin reacții chimice, fie prin formarea de complecși. În aceste cazuri, trebuie să se țină cont de câteva aspecte, care
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]
-
condițiilor de mediu. Atunci când fluorescența naturală a proteinelor nu este suficientă, în anumite experimente se folosesc fluorofori extrinseci, legați prin legături necovalente la proteine, pentru a îmbunătăți proprietățile fluorescente ale sistemului studiat. Fluorescența extrinsecă a proteinelor. Există situații în care fluorescența proteinelor poate fi indusă, pentru a fi studiate anumite caracteristici structurale, fie prin reacții chimice, fie prin formarea de complecși. În aceste cazuri, trebuie să se țină cont de câteva aspecte, care trebuie să rămână, întotdeauna, valabile: fluorescența trebuie să
BIOFIZICA ȘI BIOENERGETICA SISTEMELOR VII by Claudia Gabriela Chilom () [Corola-publishinghouse/Science/1580_a_2899]