1,026 matches
-
inocul de 106 celule pe ml din cultură și dintr-o sușă de control pozitiv. Se inoculează 5- 10 plante de tomată sau vinete, preferabil la nivelul celei de a treia frunze adevărate sau mai bătrâne (secțiunea III.6.). Se incubează până la două săptămâni la 22° C - 28° C și umiditate relativă mare, udând zilnic. Se observă ofilirea și/sau epinastia, cloroza, piticirea. Se izolează din plantele simptomatice după cum urmează: - se îndepărtează o secțiune de țesut din tulpină la doi cm
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
se îndepărtează o secțiune de țesut din tulpină la doi cm deasupra punctului inoculării. - se mărunțește și se suspendă într-un volum mic de apă distilată sterilă sau cu un tampon fosfat de 50 mM. Se pune pe placă, se incubează și se verifică existența coloniilor tipice de Ralstonia solanacearum. SECȚIUNEA III DETECTAREA ȘI IDENTIFICAREA RALSTONIA SOLANACEARUM ÎN EȘANTIOANELE DE TUBERCULI DE CARTOF Notă: Mărimea standard a eșantionului este de 200 de tuberculi. Cu toate acestea procedura se poate aplica în
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
mai puțin de 200 de tuberculi. 1. Pregătirea eșantionului pentru testare Notă: Extractul final de cartof obținut în această procedură poate fi utilizate de asemenea pentru detectarea Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Opțiuni de pre-testare dacă sunt considerate utile: (i) se incubează eșantionul la 25 - 30°C până la două săptămâni pentru a încuraja multiplicarea populațiilor mici de Ralstonia solanacearum (ii) se spală tuberculii sub jet de apă cu dezinfectanți și detergenți corespunzători. Tuberculii se usucă la aer. 1.1. Cu un scalpel
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
permite maceratului să absoarbă apă timp de 15 - 30 de minute. (ii) Se transferă taloanele într-un recipient corespunzător. Se adaugă un volum suficient de tampon de macerare pentru a acoperi taloanele. Se pune recipientul pe un agitator rotativ. Se incubează la 50 - 100 rpm timp de 4 ore la 20°C - 22°C sau timp de 16 - 24 de ore la 4°C. (iii) Se transferă taloanele într-un sac de macerare rezistent de unică folosință (de exemplu, sacul Stomacher
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
1. Se aranjează lamele pe hârtie absorbantă Se acoperă ferestrele de test cu diluția sau diluțiile antiserului. În ferestrele FITC se aplică PBS. Volumul antiserului aplicat în ferestre trebuie să fie echivalent cu volumul extractului aplicat. 2.3.2. Se incubează acoperit timp de 30 de minute la temperatura camerei. 2.3.3. Se scutură picăturile de antiser de pe lamă și se clătesc lamele cu atenție cu un tampon IF. Se spală timp de cinci minute în soluție tampon IF - Tween
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
4. Se aranjează lamele pe hârtie absorbantă. Se acoperă ferestrele de test și fereastra FITC cu diluția conjugatului FITC utilizat pentru determinarea titrului. Volumul conjugatului aplicat în ferestre trebuie să fie echivalent cu volumul antiserului aplicat. 2.3.5. Se incubează acoperit timp de 30 de minute la temperatura camerei. 2.3.6. Se scutură picăturile de conjugat de pe lamelă. Se clătesc și se spală ca mai sus (2.3.3). Se îndepărtează cu grijă excesul de umezeală. 2.3.7
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
microfiola la gheață. 3.2. Se adaugă un volum egal de tampon de acoperire din carbonat dublu concentrat (apendicele 5). Se centrifughează. 3.3. Se aplică 100 μl alicote fiecăreia dintre minim ultimele două puțuri ale plăcii de microtitrare. Se incubează o oră la 37 șC sau peste noapte la 4 șC. 3.4. Se scot extractele din puțuri. Se spală puțurile de trei ori cu PBS - Tween (apendicele 5), lăsând ultima soluție de spălare cel puțin cinci minute în puțuri
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
5), lăsând ultima soluție de spălare cel puțin cinci minute în puțuri. 3.5. Se prepară diluția corespunzătoare a antiserului de Ralstonia solanacearum în tampon de blocare (apendicele 5). Se aplică 100 μl de diluție de antiser în puțuri. Se incubează o oră la 37 șC. 3.6. Se scoate antiserul din puțuri. Se spală ca mai înainte (3.4). 3.7. Se prepară diluția corespunzătoare de conjugat de fosfatază alcalină în tampon de blocare. Se aplică 100 μl de diluție
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
șC. 3.6. Se scoate antiserul din puțuri. Se spală ca mai înainte (3.4). 3.7. Se prepară diluția corespunzătoare de conjugat de fosfatază alcalină în tampon de blocare. Se aplică 100 μl de diluție conjugată în puțuri. Se incubează o oră la 37 șC. 3.8. Se scoate conjugatul din puțuri. Puțurile se spală ca mai înainte (3.4 și 3.6). 3.9. Se prepară soluția de substrat de fosfatază alcalină (apendicele 5). Se aplică 100 μl în
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
la 37 șC. 3.8. Se scoate conjugatul din puțuri. Puțurile se spală ca mai înainte (3.4 și 3.6). 3.9. Se prepară soluția de substrat de fosfatază alcalină (apendicele 5). Se aplică 100 μl în puțuri. Se incubează timp de 30 de minute până la o oră în întuneric la temperatura camerei. 3.10. Se citește absorbanța la 409 nm. Interpretarea testului ELISA: Testul ELISA este negativ dacă densitatea optică (DO) a eșantionului este < 2 × DO a controlului negativ
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
1 μl din tamponul enzimatic X10 și 0,5 μl din enzima de restricție Ava II. 4.7.2 Se amestecă prin aspirarea ușoară în conul pipetei. Dacă rămân picături pe pereții fiolei, se rotește pulsator într-o microcentrifugă. Se incubează o oră la 37 °C. 4.7.3 Fragmentul PCR digerat se analizează prin electroforeza în gel de agar ca mai înainte (4.6). Interpretarea rezultatelor testului PCR: Testul PCR este negativ dacă nu este detectat fragmentul caracteristic de 288
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
de diluție, se aplică o suspensie de 106 celule pe ml dintr-o sușă virulentă din rasa 3 / biovar 2 de Ralstonia solanacearum drept control pozitiv pe un set de plăci separate cu mediu SMSA modificat. 5.3 Plăcile se incubează la 28 °C. Citirea plăcilor se face după trei zile. Dacă este negativă, se mai incubează până la șase zile. Coloniile de izolate virulente de Ralstonia solanacearum sunt de culoare alb-lăptos, plate, neregulate și fluide cu o colorație roșie-sângerie în centru
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
rasa 3 / biovar 2 de Ralstonia solanacearum drept control pozitiv pe un set de plăci separate cu mediu SMSA modificat. 5.3 Plăcile se incubează la 28 °C. Citirea plăcilor se face după trei zile. Dacă este negativă, se mai incubează până la șase zile. Coloniile de izolate virulente de Ralstonia solanacearum sunt de culoare alb-lăptos, plate, neregulate și fluide cu o colorație roșie-sângerie în centru și prezentând spirale sau dungi interne. 5.4 Coloniile cu morfologie caracteristică se purifică prin subcultivare
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
de test sunt infectate cu Ralstonia solanacearum. 7. Teste de îmbogățire În baza Elphinstone et al., 1996 7.1 Se transferă 100 μl de extract concentrat resuspendat în trei ml de mediu nutritiv SMSA modificat (apendicele 7). 7.2 Se incubează timp de 48 de ore și în nici un caz mai mult de 72 de ore la temperatura de 28°C, fără a închide ermetic dopul tubului, pentru a permite aerisirea. 7.3 Se fixează dopul și se centrifughează. Se utilizează
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
ca pH-ul să fie controlat după adăugarea antibioticelor și ajustat. 4. Izolarea virusului în ouăle de găină embrionate Se inoculează 0,2 ml de supernatant clarifiat în cavitatea alantoidiană a cel puțin 4 ouă de găină embrionate, puse la incubat pentru 8 până la 11 zile. În mod ideal, aceste ouă ar trebui să provină de la un lot liber de organisme patogene specifice (LOPS); dacă acest lucru nu este posibil, se admite utilizarea de ouă luate dintr-un lot recunoscut ca
jrc2655as1995 by Guvernul României () [Corola-website/Law/87809_a_88596]
-
soluție tampon de carbonat de amoniu (4.7.1) și se omogenizează timp de 20 minute folosind, de exemplu, tratamentul ultrasonic. Se încălzește la 40 °C ș se adaugă 10 μl plasmină (4.7.2), apoi se amestecă și se incubează timp de o oră la 40 °C, agitând continuu. Pentru a inhiba enzimele se adaugă 20 μl soluție de acid ε-aminocaproic (4.7.3), apoi se adaugă 200 mg uree solidă și 2 mg ditiotreitol. Observație: Pentru a obține o
jrc5187as2001 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90355_a_91142]
-
standardul FIL 73A: 1985, metoda B cu următoarele modificări: 1) Pregătirea probelor se face conform standardului FIL 122B:1992. Pentru cazeină acidă se poate folosi ca alternativă procedura de preparare a probelor descrisă în standardul FIL 73A:1985. 2) Se incubează și se evaluează numai eprubete în care s-au inoculat probe de 1g (de unt) sau de 0,1 g (de lapte praf degresat sau respectiv de cazeină/cazeinați). Nu se fac diluări zecimale. Evaluarea rezultatelor Trei rezultate negative: Cerința
jrc5187as2001 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90355_a_91142]
-
africană din Pirbright, Marea Britanie. 1.1. Descrierea testului 1.1.1. Pregătirea plăcilor 1.1.1.1. Se așează pe plăci ELISA antigenul VPCA extras din culturi de celule infectate, diluat într-un tampon carbonat-bicarbonat cu pH 9,6. Se incubează plăcile ELISA timp de o noapte la 4șC. 1.1.1.2. Se spală plăcile de trei ori prin clătire și se golesc godeurile cu o soluție salină tamponată cu fosfat (SSTF) cu pH 7,2-7,4, apoi se usucă
jrc5495as2001 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90665_a_91452]
-
µl antiser de cobai, diluat în prealabil într-un tampon de blocare, în toate godeurile, cu excepția godeurilor de CONTROL CU BLANC din placa ELISA (toate godeurile conțin în prezent un volum final de 100 µl). 1.1.5.1. Se incubează timp de 1 oră la 37ș într-un agitator rotativ. 1.1.5.2. Se spală plăcile de trei ori și se usucă în modul menționat anterior. 1.1.5.3. Se adaugă în fiecare godeu 50 µl ser de
jrc5495as2001 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90665_a_91452]
-
și se usucă în modul menționat anterior. 1.1.5.3. Se adaugă în fiecare godeu 50 µl ser de iepure anticobai conjugat cu peroxidază de hrean, diluat în prealabil într-un tampon de blocare. 1.1.5.4. Se incubează timp de 1 oră la 37șC într-un agitator rotativ. 1.1.5.5. Se spală plăcile de trei ori și se usucă în modul menționat anterior. 1.1.6. Cromogen Se prepară soluția cromogen (OFD = ortofenildiamină) conform instrucțiunilor fabricantului
jrc5495as2001 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90665_a_91452]
-
stabilă și neinfecțioasă. 2.1. Descrierea testului 2.1.1. Faza solidă 2.1.1.1. Plăcile ELISA se sensibilizează cu proteina recombinantă VP7 a VPCA de serotip 4, diluată într-un tampon carbonat/bicarbonat cu pH 9,6. Se incubează plăcile timp de o noapte la 4°C. 2.1.1.2. Se clătesc plăcile de cinci ori cu apă distilată cu conținut de 0,01% (v/v) Tween-20 (soluție de spălare). Se scutură ușor plăcile pe un material absorbant
jrc5495as2001 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90665_a_91452]
-
Serurile de testat și serurile pozitive și negative de control se diluează la 1/25 într-o SSTF +5% (m/v) de lapte praf degresat + 0,05% (v/v) Tween -20; se aplică apoi 100 µl în fiecare godeu. Se incubează timp de 1 oră la 37°C. Pentru titrare, se realizează serii de diluție din 2 în 2 începând de la 1/25 (100 µl/godeu), prin utilizarea unei coloane a plăcii pentru fiecare ser; se procedează la fel pentru controalele
jrc5495as2001 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90665_a_91452]
-
la 37°C. Pentru titrare, se realizează serii de diluție din 2 în 2 începând de la 1/25 (100 µl/godeu), prin utilizarea unei coloane a plăcii pentru fiecare ser; se procedează la fel pentru controalele pozitiv și negativ. Se incubează timp de 1 oră la 37°C. 2.1.2.2. Se clătesc plăcile conform descrierii din etapa 2.1.1.2. 2.1.3. Conjugat 2.1.3.1. Se depun 100 µl/ godeu de anticorpi antical conjugați cu
jrc5495as2001 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90665_a_91452]
-
1.2. 2.1.3. Conjugat 2.1.3.1. Se depun 100 µl/ godeu de anticorpi antical conjugați cu peroxidază de hrean; anticorpii se diluează într-o SSTF + 5% lapte degresat + 0,05% Tween-20 cu pH 7,2. Se incubează timp de 1 oră la 37°C. 2.1.3.2. Se clătesc plăcile conform descrierii din etapa 2.1.1.2. 2.1.4. Cromogen/substrat 2.1.4.1. Se adaugă 200 µl/godeu de soluție de cromogen
jrc5495as2001 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90665_a_91452]
-
Spania. 3.1. Descrierea testului 3.1.1. Plăcile ELISA 3.1.1.1. Se depune pe plăci ELISA antigenul VPCA de serotip 4 cu proteina recombinantă VP7, diluată într-un tampon carbonat/bicarbonat cu pH 9,6 și se incubează timp de o noapte la 4șC. 3.1.1.2. Se spală plăcile de 5 ori cu o soluție salină tamponată cu fosfat (SSTF) cu conținut de 0,05% (v/v) de Tween-20. 3.1.1.3. Se stabilizează placa
jrc5495as2001 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90665_a_91452]