11,491 matches
-
test Bio-Rad TeSeE), - imunodozare a PrPRes prin metoda imunometrică cu două situri, denumită metoda "sandviș", după denaturare și concentrare (test Bio-Rad TeSeE Sheep/Goat), - test chimioluminiscent ELISA bazat pe o procedură de extracție și o tehnică ELISA, care utilizează un reactiv chimioluminiscent întărit (test Enfer TSE Kit version 2.0), - imunodozare prin intermediul unui polimer chimic pentru captura selectivă a PrPSc și a unui anticorp de detecție monoclonal dirijat spre părțile conservate ale moleculei PrP (test IDEXX HerdChek BSE-Scrapie Antigen Test Kit
32006R0253-ro () [Corola-website/Law/295156_a_296485]
-
bacteriene pe tuberculii și pe plantele de cartof; (ii) detectarea Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus pe eșantioane de tuberculi și de plante de cartof; (iii) identificarea Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. ssp. sepedonicus). PRINCIPII GENERALE Protocoalele optimizate pentru diversele metode, reactivii validați și modalitățile de preparare a materialului necesar pentru teste și pentru controale figurează în apendice. În apendicele 1 se furnizează o listă a laboratoarelor incluse pentru optimizarea și validarea protocoalelor. Deoarece protocoalele implică detectarea unui organism dăunător care trebuie
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
a nivelurilor de C. m. ssp. sepedonicus la pragurile stabilite pentru metodele selecționate. Este necesară pregătirea exactă a martorilor pozitivi. Realizarea testelor în funcție de pragurile cerute implică, de asemenea, stabilirea parametrilor corecți, întreținerea și calibrarea echipamentelor, manevrarea și conservarea atentă a reactivilor și toate măsurile care vizează să împiedice contaminarea între eșantioane, de exemplu, separarea martorilor pozitivi de eșantioanele pentru teste. Trebuie aplicate norme de control al calității pentru a evita apariția oricărei greșeli, în special de ordin administrativ, în etichetare și
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
103-104 celule/ml de C. m. ssp. sepedonicus adăugate extractelor de probe care au dat anterior rezultate negative. Se pot dovedi necesare experiențe de optimizare pentru a obține niveluri maxime de sensibilitate și de specificitate în toate laboratoarele. Se folosesc reactivi și protocoale PCR validate. Se alege, de preferință, o metodă cu control intern. Se iau precauțiile necesare pentru a evita contaminarea probei cu ADN-ul țintă. Pentru a reduce pe cât posibil riscul contaminării cu ADN-ul țintă, ar trebui ca
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
unui eventual transfer de ADN. În testul PCR trebuie incluși următorii martori negativi: - extract de probă care a dat anterior rezultate negative pentru C. m. ssp. sepedonicus; - tampoane martori folosite pentru a extrage bacteria și ADN-ul din probă; - amestec reactiv pentru PCR. De asemenea, trebuie incluși aici și următorii martori pozitivi: - alicote de extracte finale repuse în suspensie, după ce s-a adăugat C. m. ssp. sepedonicus (a se vedea apendicele 2 pentru preparare); - suspensie în mediu apos de 106 celule
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
prepară matricele de test și de control pentru PCR, urmând protocoalele validate (a se vedea apendicele 6). Se prepară o diluție zecimală din extractul de ADN provenit din probă (1:10 în apă ultrapură). 6.2.2. Se prepară amestecul reactiv pentru PCR într-un mediu lipsit de orice contaminare, în conformitate cu protocoalele publicate (a se vedea apendicele 6). Protocolul PCR validat este o reacție multiplex care include și un control PCR intern. 6.2.3. Se adaugă 5 μl de extract
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
lipsit de orice contaminare, în conformitate cu protocoalele publicate (a se vedea apendicele 6). Protocolul PCR validat este o reacție multiplex care include și un control PCR intern. 6.2.3. Se adaugă 5 μl de extract de ADN la 25 μl reactiv PCR, în tuburi PCR sterile. 6.2.4. Se constituie o probă martor negativ care nu conține decât amestecul reactiv pentru PCR și se adaugă în locul probei o apă pură provenind din aceeași sursă ca și cea utilizată în amestecul
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
include și un control PCR intern. 6.2.3. Se adaugă 5 μl de extract de ADN la 25 μl reactiv PCR, în tuburi PCR sterile. 6.2.4. Se constituie o probă martor negativ care nu conține decât amestecul reactiv pentru PCR și se adaugă în locul probei o apă pură provenind din aceeași sursă ca și cea utilizată în amestecul PCR. 6.2.5. Se așază tuburile în același termociclu folosit la testul preliminar și se lansează programul PCR optimizat
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
se lansează programul PCR optimizat în mod corespunzător (a se vedea apendicele 6). 6.3. Analiza produsului reacției PCR 6.3.1. Se decodează amplimerii prin electroforeză pe gel de agaroză. O cantitate de cel puțin 12 μl de amestec reactiv de ADN amplificat, provenit de la fiecare probă, asociat cu 3 μl de tampon de încărcare (apendicele 6) se supun unei tensiuni de 5-8 V/cm pe geluri de agaroză la 2,0 % într-un tampon de EDTA (TAE) triacetat (apendicele
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
la 50 %, sulfatul de polimixină B în apă distilată. Soluțiile depozitate sunt sterilizate prin filtrare. Nota bene: Mediul bazal se conservă timp de trei luni. După adăugarea antibioticelor, mediul se conservă o lună în atmosferă refrigerată. Apendicele 6 Protocol și reactivi PCR validați Nota bene: Testele preliminare trebuie să permită detectarea reproductibilă a cel puțin 103-104 celule de C. m. ssp. sepedonicus pe mililitru de extract de probă. De asemenea, testele preliminare nu trebuie să arate nici un fals rezultat pozitiv cu
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
cct acg ga - 3' Dimensiunea prevăzută a amplimerului matricei de ADN de C. m. ssp. sepedonicus = 502 bp (în prezența primerului PSA). Dimensiunea prevăzută a amplimerului controlului PCR intern 18S rRNA = 377 bp (în prezența primerului NS). 1.2. Amestec reactiv destinat PCR Reactiv Cantitate pe reacție Concentrație finală Apă ultrapură sterilă 15,725 μl 10x tampon PCR1 (15 mM MgCl2) 2,5 μl 1 x (1,5 mM MgCl2) BSA (fracție V) (10 %) 0,25 μl 0,1 % Amestec d-
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
3' Dimensiunea prevăzută a amplimerului matricei de ADN de C. m. ssp. sepedonicus = 502 bp (în prezența primerului PSA). Dimensiunea prevăzută a amplimerului controlului PCR intern 18S rRNA = 377 bp (în prezența primerului NS). 1.2. Amestec reactiv destinat PCR Reactiv Cantitate pe reacție Concentrație finală Apă ultrapură sterilă 15,725 μl 10x tampon PCR1 (15 mM MgCl2) 2,5 μl 1 x (1,5 mM MgCl2) BSA (fracție V) (10 %) 0,25 μl 0,1 % Amestec d-nTP (20 mM
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
au fost optimizate pentru extragerea nucleelor de stoloni de cartofi, utilizând metoda omogenizării și a purificării ADN-ului după Pastrik (2000) [a se vedea secțiunile 6.1. (a) și 6.2]. Va fi necesară o nouă optimizare a concentrațiilor de reactivi, în cazul în care se utilizează extragerea prin agitație sau alte metode de izolare a ADN-ului. 1.3. Condiții ale reacției PCR Se execută următorul program: 1 ciclu de: (i) 3 minute la 95 °C: denaturarea matricei ADN; 10
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
0 Tampon tri 48,4 g Acid acetic glacial 11,42 ml EDTA (sare disodică) 3,72 g Apă distilată 1,00 l Înainte de utilizare se diluează până la 1x. Disponibil și în comerț (de exemplu, Invitrogen sau echivalent). Apendicele 7 Reactivi validați pentru testul FISH 1. Oligosonde Sonda CMS-CY3-01 specifică pentru Cms 5'-ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg-3' Sonda eubacteriană EUB-338-FITC nespecifică 5'-gct gcc tcc cgt agg agt-3' 2. Soluție de fixare [ATENȚIE! FIXATIVUL CONȚINE PARAFORMALDEHIDĂ, CARE
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
altor teste. 12 Test de imunofluorescență (IF). Se utilizează întotdeauna un anticorp policlonal pentru testele de imunofluorescență. Se poate obține o specificitate mai mare (a se vedea secțiunea 4), asociind anticorpului menționat anticorpi monoclonali suplimentari. 13 Test PCR. Se utilizează reactivi și protocoale PCR validate în mod corespunzător (a se vedea secțiunea 6). 14 Test FISH. Se utilizează reactivi și protocoale validate (a se vedea secțiunea 5). 15 Izolare selectivă. Asociată cu utilizarea unui mediu MTNA sau NCP-88 și a unei
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
poate obține o specificitate mai mare (a se vedea secțiunea 4), asociind anticorpului menționat anticorpi monoclonali suplimentari. 13 Test PCR. Se utilizează reactivi și protocoale PCR validate în mod corespunzător (a se vedea secțiunea 6). 14 Test FISH. Se utilizează reactivi și protocoale validate (a se vedea secțiunea 5). 15 Izolare selectivă. Asociată cu utilizarea unui mediu MTNA sau NCP-88 și a unei diluări la 1/100 de extract concentrat repus în suspensie, izolarea selectivă constituie, în numeroase cazuri, o metodă
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
cultură a R. solanacearum Apendicele 3 (A) Materialul de control standardizat disponibil în comerț (B) Pregătirea controalelor Apendicele 4 Tampoanele pentru procedurile de testare Apendicele 5 Stabilirea gradului de contaminare la testele IF și FISH Apendicele 6 Protocoalele PCR și reactivii validați Apendicele 7 Reactivi validați pentru testul FISH Apendicele 8 Condiții de cultură pentru tomate și vinete Bibliografie PRINCIPII GENERALE Protocoalele optimizate pentru diversele metode, reactivii validați și detaliile pregătirii materialului necesar pentru teste și controale figurează în apendice. O
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
Apendicele 3 (A) Materialul de control standardizat disponibil în comerț (B) Pregătirea controalelor Apendicele 4 Tampoanele pentru procedurile de testare Apendicele 5 Stabilirea gradului de contaminare la testele IF și FISH Apendicele 6 Protocoalele PCR și reactivii validați Apendicele 7 Reactivi validați pentru testul FISH Apendicele 8 Condiții de cultură pentru tomate și vinete Bibliografie PRINCIPII GENERALE Protocoalele optimizate pentru diversele metode, reactivii validați și detaliile pregătirii materialului necesar pentru teste și controale figurează în apendice. O listă a laboratoarelor reținute
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
Stabilirea gradului de contaminare la testele IF și FISH Apendicele 6 Protocoalele PCR și reactivii validați Apendicele 7 Reactivi validați pentru testul FISH Apendicele 8 Condiții de cultură pentru tomate și vinete Bibliografie PRINCIPII GENERALE Protocoalele optimizate pentru diversele metode, reactivii validați și detaliile pregătirii materialului necesar pentru teste și controale figurează în apendice. O listă a laboratoarelor reținute pentru optimizarea și validarea protocoalelor este prevăzută în apendicele 1. Dat fiind faptul că protocoalele implică detectarea unui organism dăunător care trebuie
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
și reproductibilă a nivelurilor de R. solanacearum la pragurile stabilite prin metodele selecționate. Pregătirea exactă a controalelor pozitive este imperativă. Efectuarea testelor în conformitate cu pragurile impuse implică, de asemenea, stabilirea parametrilor corecți, întreținerea și calibrarea echipamentelor, manipularea și păstrarea corectă a reactivilor și toate măsurile menite să împiedice contaminarea între eșantioane, de exemplu, separarea controalelor pozitive și a eșantioanelor testelor. Trebuie aplicate standarde de control de calitate pentru a evita erori administrative și de alt gen, în special în ceea ce privește etichetarea și documentarea
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
celule pe ml de R. solanacearum adăugate la extractele de eșantioane care au dat anterior rezultate negative. Poate fi necesară efectuarea unor experimente de optimizare în toate laboratoarele pentru a obține niveluri maxime de sensibilitate și de specificitate. Se folosesc reactive și protocoale PCR validate (a se vedea apendicele 6). Se alege, de preferință, o metodă cu control intern. Se iau măsurile de precauție necesare pentru a evita contaminarea eșantionului cu ADN țintă. Testul PCR ar trebui realizat de tehnicieni experimentați
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
apariție a unui transfer de ADN. Următoarele controale negative ar trebui incluse în testul PCR: - Extractul eșantionului care a produs anterior rezultate negative pentru depistarea R. solanacearum; - Tampoanele de control utilizate pentru a extrage bacteria și ADN din eșantion; - Amestecul reactiv pentru PCR. Următoarele controale pozitive ar trebui incluse: - Alicote ale extractelor concentrate resuspendate la care s-a adăugat R. solanacearum (preparare: a se vedea apendicele 3 B). - Suspensie de 106 de celule pe ml dintr-un izolat virulent de R.
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
1. Se prepară, pentru PCR, matricele de testare și de control în conformitate cu protocoalele validate (secțiunea VI.A.6). Se prepară o diluție decimală din extractul de eșantion de ADN (1:10 în apă ultrapură). 6.2.2. Se prepară amestecul reactiv corespunzător pentru PCR într-un mediu neinfectat în conformitate cu protocoalele publicate (apendicele 6). În cazul în care este posibil, se recomandă utilizarea unui protocol PCR compus care include, de asemenea, un control intern al PCR. 6.2.3. Se adaugă 2-5
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
apendicele 6). În cazul în care este posibil, se recomandă utilizarea unui protocol PCR compus care include, de asemenea, un control intern al PCR. 6.2.3. Se adaugă 2-5 μl de extract de ADN pe 25 μl de mediu reactiv PCR în tuburi PCR sterile în conformitate cu protocoalele PCR (a se vedea apendicele 6). 6.2.4. Se include un eșantion de control negativ conținând numai un amestec reactiv pentru PCR și se adaugă la aceeași sursă de apă ultrapură ca
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
adaugă 2-5 μl de extract de ADN pe 25 μl de mediu reactiv PCR în tuburi PCR sterile în conformitate cu protocoalele PCR (a se vedea apendicele 6). 6.2.4. Se include un eșantion de control negativ conținând numai un amestec reactiv pentru PCR și se adaugă la aceeași sursă de apă ultrapură ca și cea utilizată în amestecul pentru PCR în locul eșantionului. 6.2.5. Tuburile se introduc în același ciclor termic ca și cel utilizat la testul preliminar și se
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]