11,436 matches
-
7,6 ± 0,2. Culturile celulare care se folosesc pentru inoculare cu țesuturi trebuie să fie de preferință tinere (de patru până la 48 de ore) și aflate în faza de creștere activă (non confluentă) în momentul inoculării. 2. Inocularea culturilor celulare Se inoculează o suspensie de organe tratată cu antibiotice în culturile celulare la două diluții: diluția inițială și o diluție a acesteia la 1:10, ajungându-se respectiv la diluții finale ale materialului tisular într-un mediu de culturi celulare
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
țesuturi trebuie să fie de preferință tinere (de patru până la 48 de ore) și aflate în faza de creștere activă (non confluentă) în momentul inoculării. 2. Inocularea culturilor celulare Se inoculează o suspensie de organe tratată cu antibiotice în culturile celulare la două diluții: diluția inițială și o diluție a acesteia la 1:10, ajungându-se respectiv la diluții finale ale materialului tisular într-un mediu de culturi celulare la 1:100 și 1:1000 (pentru a se evita interferențele omoloage
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
celulare Se inoculează o suspensie de organe tratată cu antibiotice în culturile celulare la două diluții: diluția inițială și o diluție a acesteia la 1:10, ajungându-se respectiv la diluții finale ale materialului tisular într-un mediu de culturi celulare la 1:100 și 1:1000 (pentru a se evita interferențele omoloage). Trebuie inoculate cel puțin două culturi celulare (a se vedea partea I III 1). Raportul dintre dimensiunea inoculatului și volumul mediului de cultură celulară trebuie să fie de
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
o diluție a acesteia la 1:10, ajungându-se respectiv la diluții finale ale materialului tisular într-un mediu de culturi celulare la 1:100 și 1:1000 (pentru a se evita interferențele omoloage). Trebuie inoculate cel puțin două culturi celulare (a se vedea partea I III 1). Raportul dintre dimensiunea inoculatului și volumul mediului de cultură celulară trebuie să fie de aproximativ 1:10. Pentru fiecare diluție și fiecare cultură celulară, trebuie să se utilizeze cel puțin 2 cm² de
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
un mediu de culturi celulare la 1:100 și 1:1000 (pentru a se evita interferențele omoloage). Trebuie inoculate cel puțin două culturi celulare (a se vedea partea I III 1). Raportul dintre dimensiunea inoculatului și volumul mediului de cultură celulară trebuie să fie de aproximativ 1:10. Pentru fiecare diluție și fiecare cultură celulară, trebuie să se utilizeze cel puțin 2 cm² de celule, ceea ce corespunde unei cupule într-o placă celulară cu 24 de cupule. Se recomandă utilizarea plăcilor
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
evita interferențele omoloage). Trebuie inoculate cel puțin două culturi celulare (a se vedea partea I III 1). Raportul dintre dimensiunea inoculatului și volumul mediului de cultură celulară trebuie să fie de aproximativ 1:10. Pentru fiecare diluție și fiecare cultură celulară, trebuie să se utilizeze cel puțin 2 cm² de celule, ceea ce corespunde unei cupule într-o placă celulară cu 24 de cupule. Se recomandă utilizarea plăcilor de cultură celulară, dar se admit și alte suporturi care prezintă o suprafață de
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
dintre dimensiunea inoculatului și volumul mediului de cultură celulară trebuie să fie de aproximativ 1:10. Pentru fiecare diluție și fiecare cultură celulară, trebuie să se utilizeze cel puțin 2 cm² de celule, ceea ce corespunde unei cupule într-o placă celulară cu 24 de cupule. Se recomandă utilizarea plăcilor de cultură celulară, dar se admit și alte suporturi care prezintă o suprafață de creștere similară sau superioară. 3. Incubarea culturilor celulare Se incubează culturile celulare inoculate la 15°C timp de
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
fie de aproximativ 1:10. Pentru fiecare diluție și fiecare cultură celulară, trebuie să se utilizeze cel puțin 2 cm² de celule, ceea ce corespunde unei cupule într-o placă celulară cu 24 de cupule. Se recomandă utilizarea plăcilor de cultură celulară, dar se admit și alte suporturi care prezintă o suprafață de creștere similară sau superioară. 3. Incubarea culturilor celulare Se incubează culturile celulare inoculate la 15°C timp de șapte până la zece zile. In cazul în care culoarea mediului de
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
cm² de celule, ceea ce corespunde unei cupule într-o placă celulară cu 24 de cupule. Se recomandă utilizarea plăcilor de cultură celulară, dar se admit și alte suporturi care prezintă o suprafață de creștere similară sau superioară. 3. Incubarea culturilor celulare Se incubează culturile celulare inoculate la 15°C timp de șapte până la zece zile. In cazul în care culoarea mediului de cultură celulară se modifică de la roșu la galben, indicând o acidifiere a mediului, se ajustează pH-ul cu ajutorul unei
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
corespunde unei cupule într-o placă celulară cu 24 de cupule. Se recomandă utilizarea plăcilor de cultură celulară, dar se admit și alte suporturi care prezintă o suprafață de creștere similară sau superioară. 3. Incubarea culturilor celulare Se incubează culturile celulare inoculate la 15°C timp de șapte până la zece zile. In cazul în care culoarea mediului de cultură celulară se modifică de la roșu la galben, indicând o acidifiere a mediului, se ajustează pH-ul cu ajutorul unei soluții sterile de bicarbonat
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
se admit și alte suporturi care prezintă o suprafață de creștere similară sau superioară. 3. Incubarea culturilor celulare Se incubează culturile celulare inoculate la 15°C timp de șapte până la zece zile. In cazul în care culoarea mediului de cultură celulară se modifică de la roșu la galben, indicând o acidifiere a mediului, se ajustează pH-ul cu ajutorul unei soluții sterile de bicarbonat sau cu ajutorul unor substanțe echivalente pentru a garanta sensibilitatea celulei la infecția virală. La fiecare șase luni cel puțin
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
acidifiere a mediului, se ajustează pH-ul cu ajutorul unei soluții sterile de bicarbonat sau cu ajutorul unor substanțe echivalente pentru a garanta sensibilitatea celulei la infecția virală. La fiecare șase luni cel puțin sau dacă se suspectează o scădere a sensibilității celulare, se efectuează titrarea stocurilor de virus SHV și NHI congelate, pentru a se verifica sensibilitatea culturilor celulare la infecție. În partea IV este indicată o procedură recomandată. 4. Microscopie Culturile celulare inoculate trebuie să fie verificate cu regularitate (cel puțin
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
echivalente pentru a garanta sensibilitatea celulei la infecția virală. La fiecare șase luni cel puțin sau dacă se suspectează o scădere a sensibilității celulare, se efectuează titrarea stocurilor de virus SHV și NHI congelate, pentru a se verifica sensibilitatea culturilor celulare la infecție. În partea IV este indicată o procedură recomandată. 4. Microscopie Culturile celulare inoculate trebuie să fie verificate cu regularitate (cel puțin de trei ori pe săptămână), pentru a se observa apariția unui ECP la o mărire de 40
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
puțin sau dacă se suspectează o scădere a sensibilității celulare, se efectuează titrarea stocurilor de virus SHV și NHI congelate, pentru a se verifica sensibilitatea culturilor celulare la infecție. În partea IV este indicată o procedură recomandată. 4. Microscopie Culturile celulare inoculate trebuie să fie verificate cu regularitate (cel puțin de trei ori pe săptămână), pentru a se observa apariția unui ECP la o mărire de 40 până la 150 de ori. Dacă este clară producerea unui ECP, încep imediat procedurile de
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
este clară producerea unui ECP, încep imediat procedurile de identificare a virusului în conformitate cu partea I IV. 5. Sub-cultură Dacă nu se produce nici un ECP după o primă incubație de șapte până la zece zile, se procedează la o sub-cultură cu culturile celulare proaspete folosindu-se o suprafață celulară similară cu cea a culturii primare. Părți alicote din mediu (lichid de suprafață) provenind de la toate culturile/cupulele care constituie cultura primară se reunesc, în funcție de cultura de celule, la șapte sau zece zile de la
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
imediat procedurile de identificare a virusului în conformitate cu partea I IV. 5. Sub-cultură Dacă nu se produce nici un ECP după o primă incubație de șapte până la zece zile, se procedează la o sub-cultură cu culturile celulare proaspete folosindu-se o suprafață celulară similară cu cea a culturii primare. Părți alicote din mediu (lichid de suprafață) provenind de la toate culturile/cupulele care constituie cultura primară se reunesc, în funcție de cultura de celule, la șapte sau zece zile de la inoculare. Amestecurile respective sunt apoi inoculate
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
cea a culturii primare. Părți alicote din mediu (lichid de suprafață) provenind de la toate culturile/cupulele care constituie cultura primară se reunesc, în funcție de cultura de celule, la șapte sau zece zile de la inoculare. Amestecurile respective sunt apoi inoculate în culturile celulare omoloage, nediluate și diluate la 1:10 (dând diluții finale ale lichidului de suprafață de respectiv 1:10 și 1:100), după descrierea din partea I III 2. Se pot de asemenea inocula părți alicote de 10% din mediul care constituie
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
diluții finale ale lichidului de suprafață de respectiv 1:10 și 1:100), după descrierea din partea I III 2. Se pot de asemenea inocula părți alicote de 10% din mediul care constituie cultura primară direct într-o cupulă cu culturi celulare proaspete (sub-culturi de cupulă la cupulă). Inocularea poate fi precedată de o preincubare a diluțiilor cu antiser împotriva virusului NPI la o diluție corespunzătoare, după descrierea din partea I II 3. Se incubează apoi culturile inoculate timp de șapte până la zece
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
membrană cu grad scăzut de absorbție a proteinelor). In afara acestei sub-culturi, procedurile sunt aceleași cu cele aplicate în cazul ECP toxice. IV. Identificarea virusului 1. Teste de identificare a virusului Dacă s-a produs un ECP într-o cultură celulară, mediul (lichidul de suprafață) este colectat și examinat după una sau mai multe din tehnicile următoare: neutralizare, IF, ELISA. Dacă testele nu au permis identificarea definitivă a virusului într-o săptămână, lichidul de suprafață trebuie transferat către un laborator de
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
xg) sau prin filtrare cu un filtru cu membrană (0,45 μm) cu o membrană cu grad scăzut de absorbție a proteinelor, apoi se diluează lichidul de suprafață la 1/100 și 1:10 000 într-un mediu de cultură celulară. Se amestecă părți alicote din cele două diluții ale lichidului de suprafață și se incubează separat timp de 60 de minute la 15°C în părți egale cu următorii reactivi: - ser conținând un grup de anticorpi specifici împotriva virusului SHV
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
vol:vol) (1), - grup de antiseruri împotriva serotipurilor indigene ale virusului NPI la o diluție de 1:50 (vol:vol) (1), - mediu de cultură singur (control pozitiv). Pentru fiecare din amestecurile de suprafață viral-ser, se inoculează cel puțin două culturi celulare cu 50 de μl de amestec de lichid de suprafață și de ser și se incubează la 15°C. Se controlează apariția unui ECP în conformitate cu partea I III 4. Anumite tulpini ale virusului SHV nu reacționează la testele de neutralizare
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
a căror densitate să dea o confluență de aproximativ 60 până la 90 % după 24 de ore de cultură. Celulele EPC sunt recomandate în acest scop datorită aderenței lor ridicate la suprafețele de sticlă, dar se pot folosi și alte tulpini celulare, ca BF-2, RTG-2 sau FHM. Atunci când celulele s-au depus pe suprafața de sticlă (aproximativ la o oră după însămânțare) sau atunci când aceste culturi au fost incubate timp de 24 de ore maximum, se inoculează virusul care trebuie identificat. Se
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
de obiectiv de x 25 sau x 40, ale căror deschideri numerice sunt de >0,7 și respectiv >1,3. Tehnica IF descrisă mai sus este indicată cu valoare de exemplu. Se pot aplica și alte tehnici IF (cu privire la culturile celulare, la fixare și anticorpii de referință de calitate) dacă s-a dovedit eficacitatea acestora. 4. ELISA Se acoperă cupulele din plăcile de microtitrare timp de o noapte cu diluțiile recomandate din fracțiuni de imunoglobuline purificate provenind din seruri de referință
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
a proteinelor). II.3. Tratamentul lichidului de suprafață cu antiseruri de diagnostic Suspensia de organe tratată cu antibiotice sau trecută printr-un filtru cu membrană este diluată la 1:10 și la 1:1 000 într-un mediu de cultură celulară iar părți alicote se amestecă și se incubează timp de 60 de minute la 15°C cu părți egale din reactivii enumerați în partea I IV 2. III.1. Culturi celulare și medii A se vedea partea I III 1
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]
-
la 1:1 000 într-un mediu de cultură celulară iar părți alicote se amestecă și se incubează timp de 60 de minute la 15°C cu părți egale din reactivii enumerați în partea I IV 2. III.1. Culturi celulare și medii A se vedea partea I III 1. III.2. Inocularea culturilor celulare A se vedea partea I III 3. III.4. Microscopie Se inspectează în fiecare zi culturile celulare inoculate pentru a se distinge apariția unui ECP la
jrc4925as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90093_a_90880]