11,436 matches
-
după tratament și reprezintă doar o măsură indirectă a efectelor citotoxice/citostatice. Cu toate acestea, indexul mitotic este acceptabil pentru culturile în suspensie în care alte determinări de toxicitate pot să fie dificile și nepractice. Datele de cinetică a ciclului celular, cum ar fi timpul de generare medie (TGM), ar putea să reprezinte informații suplimentare. TGM este totuși o medie generală, care nu demonstrează întotdeauna existența unei subpopulații întârziate; chiar și creșterile ușoare ale timpului de generare medie pot să genereze
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
de încercat ar trebui să se realizeze atât în prezența, cât și în absența activării metabolice, timp de 3-6 ore, și să se procedeze la prelevarea probelor după un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal de la inițierea tratamentului (12). Dacă rezultatele testului sunt negative, atât în prezența, cât și în absența activării, ar trebui să se repete testul fără activare, cu tratament continuu până în momentul prelevării probelor care să fie egal cu aproximativ de
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
Dacă rezultatele testului sunt negative, atât în prezența, cât și în absența activării, ar trebui să se repete testul fără activare, cu tratament continuu până în momentul prelevării probelor care să fie egal cu aproximativ de 1,5 ori durata ciclului celular normal. S-ar putea ca unele produse chimice să fie detectate mai ușor, prin prelungirea timpului de tratament/prelevare a probelor la mai mult de 1,5 ori durata ciclului celular. Rezultatele negative obținute în prezența activării metabolice necesită o
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
egal cu aproximativ de 1,5 ori durata ciclului celular normal. S-ar putea ca unele produse chimice să fie detectate mai ușor, prin prelungirea timpului de tratament/prelevare a probelor la mai mult de 1,5 ori durata ciclului celular. Rezultatele negative obținute în prezența activării metabolice necesită o confirmare pentru fiecare caz. Pentru cazurile în care se consideră că nu este necesară confirmarea rezultatelor negative, trebuie să se prezinte o justificare. 1.4.3.4. Prepararea cromozomilor Culturile celulare
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
celular. Rezultatele negative obținute în prezența activării metabolice necesită o confirmare pentru fiecare caz. Pentru cazurile în care se consideră că nu este necesară confirmarea rezultatelor negative, trebuie să se prezinte o justificare. 1.4.3.4. Prepararea cromozomilor Culturile celulare se tratează cu Colcemid(r) sau colchicină, de obicei timp de 1-3 ore înainte de recoltare. Fiecare cultură celulară se recoltează și se prelucrează separat pentru prepararea cromozomilor. Prepararea cromozomilor include tratamentul hipotonic al celulelor, precum și fixarea și colorarea acestora. 1
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
se consideră că nu este necesară confirmarea rezultatelor negative, trebuie să se prezinte o justificare. 1.4.3.4. Prepararea cromozomilor Culturile celulare se tratează cu Colcemid(r) sau colchicină, de obicei timp de 1-3 ore înainte de recoltare. Fiecare cultură celulară se recoltează și se prelucrează separat pentru prepararea cromozomilor. Prepararea cromozomilor include tratamentul hipotonic al celulelor, precum și fixarea și colorarea acestora. 1.4.3.5. Analiza Toate lamelele, inclusiv cele cu martorii pozitivi și negativi, ar trebui să fie codificate
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
faptul că substanța de testat este capabilă să inhibe procesele mitotice și să producă aberații ale numărului de cromozomi. O creștere a numărului de celule cu cromozomi endoreduplicați poate să indice faptul că substanța de testat poate inhiba avansarea ciclului celular (17) (18). Dacă rezultatele obținute pentru o substanță de testat nu îndeplinesc criteriile menționate anterior, se consideră că substanța respectivă nu este mutagenă în sistemul respectiv. Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în rare
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
celulelor, - caracteristicile cariotipului și motivul alegerii celulelor utilizate, - absența micoplasmei, dacă este cazul, - date privind durata ciclului celular, - sexul donatorilor de sânge, sângele complet sau limfocite izolate, mitogenul utilizat, - numărul de reînsămânțări, dacă este cazul, - metodele de întreținere a culturilor celulare, dacă este cazul, - numărul modal de cromozomi. Condițiile de testare: - identitatea substanței de inhibare a metafazei, concentrațiile acesteia și timpul de expunere a celulelor, - justificarea alegerii concentrațiilor și numărului de culturi, inclusiv datele de citotoxicitate și limitele de solubilitate, dacă
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
inclusiv datele de citotoxicitate și limitele de solubilitate, dacă sunt disponibile, - compoziția mediului, concentrația de CO2, dacă este cazul, - concentrația substanței de testat, - volumul vehiculului și al substanței de testat adăugate, - temperatura de incubare, - timpul de incubare, - durata tratamentului, - densitatea celulară la însămânțare, dacă este cazul, - tipul și compoziția sistemului de activare metabolică, inclusiv criteriile de acceptabilitate, - martorii pozitivi și negativi, - metodele de preparare a lamelelor, - criteriile pentru numărătoarea aberațiilor, - numărul de metafaze analizate, - metodele de măsurare a toxicității, - criteriile utilizate
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
de preparare a lamelelor, - criteriile pentru numărătoarea aberațiilor, - numărul de metafaze analizate, - metodele de măsurare a toxicității, - criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure. Rezultatele: - semnele de toxicitate, de exemplu gradul de confluență, datele privind ciclul celular, numărătoarea celulelor, indexul mitotic, - semnele de precipitare, - datele privind valoarea pH-ului și osmolalitatea mediului de tratare, dacă s-au determinat, - definirea aberațiilor, inclusiv a lacunelor, - numărul de celule cu aberații cromozomiale și tipul aberațiilor cromozomiale, prezentate separat pentru fiecare
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
tratare ar trebui să fie justificate în mod științific. Prelevarea probelor după tratament ar trebui să se realizeze în două momente diferite din aceeași zi. Pentru rozătoare, primul interval de timp este egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal (acesta din urmă fiind în mod normal de 12-18 ore) după tratament. Deoarece timpul necesar pentru absorbția și metabolismul substanței de testat, precum și acțiunea acesteia asupra cineticii ciclului celular pot să aibă efecte asupra timpului optim pentru detectarea aberației
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
timp este egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal (acesta din urmă fiind în mod normal de 12-18 ore) după tratament. Deoarece timpul necesar pentru absorbția și metabolismul substanței de testat, precum și acțiunea acesteia asupra cineticii ciclului celular pot să aibă efecte asupra timpului optim pentru detectarea aberației cromozomiale, se recomandă să se procedeze la o altă prelevare de probe la 24 de ore după prima prelevare. Dacă administrarea dozelor durează mai mult de o zi, ar trebui
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
probe la 24 de ore după prima prelevare. Dacă administrarea dozelor durează mai mult de o zi, ar trebui să se procedeze la o prelevare de probe la un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal după tratamentul final. Înainte de sacrificare, se procedează la injectarea intraperitoneală a animalelor cu o doză corespunzătoare de agent de inhibare a metafazei (de ex. Colcemid(r) sau colchicină). Probele de la animale se prelevează apoi la un interval corespunzător. Pentru
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
de celule poliploide poate să indice faptul că substanța de testat poate produce aberații ale numărului de cromozomi. O creștere a numărului de celule cu cromozomi enderoduplicați poate să indice faptul că substanța de testat poate să inhibe avansarea ciclului celular (7) (8). Dacă rezultatele pentru o substanță de testat nu îndeplinesc criteriile menționate anterior, substanța respectivă se consideră a fi nemutagenă în prezentul test. Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
dovezi că substanța de testat sau un metabolit reactiv nu atinge țesutul-țintă utilizarea prezentului test nu este potrivită. A se vedea și introducerea generală din partea B. 1.2. DEFINIȚII Centromer (kinetocor): porțiune sau porțiuni dintr-un cromozom care în timpul diviziunii celulare este legată cu fibrele fusului mitotic, ceea ce permite deplasarea ordonată a cromozomilor fiice către polii celulelor fiice. Micronuclee: nuclee mici, separate de nucleele principale ale celulelor și prezente în plus față de acestea, produse în timpul telofazei mitozei (meioză) de către fragmentele de
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
bacterian de mutație inversă este rapid, ieftin și relativ ușor de realizat. Multe dintre sușele experimentale au câteva particularități care le fac mai sensibile pentru detectarea de mutații, inclusiv secvențe de ADN sensibile la mutații în locurile de inversare, permeabilitate celulară crescută pentru moleculele mari și eliminarea sistemelor de regenerare a ADN sau intensificarea proceselor care au tendința să inducă erori în timpul regenerării ADN. Specificitatea sușelor experimentale poate să furnizeze informații utile privind tipurile de mutații care sunt induse de către agenții
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
directoare OCDE TG 476, Testul in vitro de mutație genică pe celule de mamifere (1997). 1.1. INTRODUCERE Testul in vitro de mutație genică pe celule de mamifere se poate utiliza pentru detectarea mutațiilor genice produse de substanțele chimice. Liniile celulare corespunzătoare conțin celule de limfom de șoarece L5178Y, liniile CHO, CHO-AS52 și V79 de celule de hamster chinezesc și celule limfoblastoide umane TK6 (1). În liniile celulare menționate, efectele genetice cel mai frecvent măsurate sunt o mutație în pozițiile timidin
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
mamifere se poate utiliza pentru detectarea mutațiilor genice produse de substanțele chimice. Liniile celulare corespunzătoare conțin celule de limfom de șoarece L5178Y, liniile CHO, CHO-AS52 și V79 de celule de hamster chinezesc și celule limfoblastoide umane TK6 (1). În liniile celulare menționate, efectele genetice cel mai frecvent măsurate sunt o mutație în pozițiile timidin kinază (TK) și hipoxantin-guanină fosforibozil transferază (HPRT), precum și o transgenă de xantin-guanină fosforibozil transferază (XPRT). Testele de mutație TK, HPRT și XPRT permit detectarea diferitelor spectre ale
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
permită detectarea fenomenelor genetice (de ex. deleții importante) care nu sunt detectate în locusul HPRT la cromozomii X (2) (3) (4) (5) (6). În testul in vitro de mutație genică pe celule de mamifere, se pot utiliza culturi de linii celulare stabilite sau sușe celulare. Celule utilizate se selectează în funcție de capacitatea de creștere în cultură și de stabilitatea frecvenței de mutație spontană. Testele realizate in vitro necesită, în general, utilizarea unei surse exogene de activare metabolică. Sistemul de activare metabolică de
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
de ex. deleții importante) care nu sunt detectate în locusul HPRT la cromozomii X (2) (3) (4) (5) (6). În testul in vitro de mutație genică pe celule de mamifere, se pot utiliza culturi de linii celulare stabilite sau sușe celulare. Celule utilizate se selectează în funcție de capacitatea de creștere în cultură și de stabilitatea frecvenței de mutație spontană. Testele realizate in vitro necesită, în general, utilizarea unei surse exogene de activare metabolică. Sistemul de activare metabolică de acest tip nu poate
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
Celulele cu deficit de timidin chinază (TK) datorită mutației TK+/- →TK-/- sunt rezistente la efectele citotoxice ale trifluorotimidinei (TFT), un analog al pirimidinei. Celulele care posedă timidin chinază sunt sensibile la TFT, care produce inhibarea metabolismului celular și întrerupe diviziunea celulară. Prin urmare, celulele mutante pot să prolifereze în prezența TFT, în timp ce celulele normale, care conțin timidin chinază, nu pot. În mod similar, celulele cu deficit de HPRT sau XPRT sunt selectate în funcție de rezistența la 6-tioguanină (TG) sau 8-azaguanină (AG). Dacă
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
puțin egal cu de 10 ori inversul frecvenței de mutație spontană. Cu toate acestea, se recomandă utilizarea a minimum 106 celule. Pentru a asigura o performanță constantă a testului, ar trebui să se dispună de date anterioare specifice privind sistemul celular utilizat. 1.4.1.2. Mediile și condițiile de cultură Se recomandă utilizarea mediilor de cultură și a condițiilor de incubare (vasele de cultură, temperatura, concentrația CO2, și umiditatea) corespunzătoare. Alegerea mediilor ar trebui să se facă în funcție de sistemele selective
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
sistem de activare metabolică poate să depindă de clasa chimică a substanței de testat. În unele cazuri, ar putea fi convenabilă utilizarea mai multor concentrații ale fracției postmitocondriale. O serie de realizări, inclusiv crearea prin inginerie genetică a unor linii celulare care exprimă enzime activatoare specifice, pot să furnizeze potențialul pentru o activare endogenă. Alegerea liniilor celulare ar trebui să fie justificată din punct de vedere științific (de ex. prin importanța izoenzimei citocromului P450 pentru metabolismul substanței de testat). 1.4
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
cazuri, ar putea fi convenabilă utilizarea mai multor concentrații ale fracției postmitocondriale. O serie de realizări, inclusiv crearea prin inginerie genetică a unor linii celulare care exprimă enzime activatoare specifice, pot să furnizeze potențialul pentru o activare endogenă. Alegerea liniilor celulare ar trebui să fie justificată din punct de vedere științific (de ex. prin importanța izoenzimei citocromului P450 pentru metabolismul substanței de testat). 1.4.1.5. Prepararea substanței de testat Substanțele de testat în stare solidă ar trebui să se
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
vedere la determinarea dozei maxime sunt citotoxicitatea, solubilitatea în sistemul de testare și modificările de pH sau osmolalitate. Citotoxicitatea ar trebui să se determine cu și fără activare metabolică în experimentul principal, utilizând un indicator corespunzător al integrității și dezvoltării celulare, ca eficacitatea clonării relative (supraviețuirea) sau creșterea totală relativă. Ar putea fi utilă determinarea citotoxicității și solubilității într-un experiment preliminar. Ar trebui să se utilizeze cel puțin patru concentrații analizabile. Dacă o substanță este citototoxică, concentrațiile respective ar trebui
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]