3,282 matches
-
d. *6) Cultivarea riscă să eșueze din cauza concurenței sau a efectului inhibitor al bacteriilor saprofite. În cazul în care populațiile mari de bacterii saprofite sunt suspectate că ar putea afecta fiabilitatea izolării, testele de izolare trebuie reîncepute după o nouă diluție a probei. *7) Identificarea fiabilă a culturilor pure prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise la secțiunea VI.B. *8) Testul de patogenitate este descris în secțiunea VI.C. 2. Metode pentru detecția și identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
poate fi atinsă în cazul în care se folosesc extracte de probe proaspăt preparate. Cu toate acestea, metoda se aplică, de asemenea, extractelor cu glicerol păstrate la o temperatură cuprinsă între - 68 și - 86°C. Se prepară, pentru control pozitiv, diluții zecimale de suspensie de 10^6 ufc/ml dintr-o tulpină virulentă biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Pentru a se evita orice posibilitate de contaminare, controalele pozitive se prepară complet separat de
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
mod ca și probele. 4.1.1. Testul se efectuează cu ajutorul unei tehnici corespunzătoare de însămânțare cu scopul de a asigura diluarea întregii populații care formează colonii de saprofite. Se însămânțează 50-100 f2μl din fiecare probă de extract și fiecare diluție. 4.1.2. Plăcile se incubează la 28°C. Citirea plăcilor se face după 48 de ore, iar apoi zilnic pe o perioadă de până la 6 zile. Coloniile tipice de Ralstonia solanacearum în mediul nutritiv SMSA sunt de culoare alb-lăptos
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
Se utilizează o sursă validată de anticorpi de Ralstonia solanacearum (vezi website-ul http://forum. europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Se recomandă stabilirea titrului pentru fiecare lot nou de anticorpi. Titrul se definește ca fiind cea mai mare diluție la care se obține o reacție optimă atunci când se testează o suspensie de 10^5-10^6 celule pe ml din tulpina omologă de Ralstonia solanacearum folosindu-se un conjugat corespunzător de izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Toate antiserurile
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
celule pe ml din tulpina omologă de Ralstonia solanacearum folosindu-se un conjugat corespunzător de izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Toate antiserurile policlonale validate au un titru de imunofluorescență de cel puțin 1: 2.000. La efectuarea testului, diluțiile de lucru ale anticorpilor trebuie să fie aproximativ egale sau egale cu cele ale titrului. Testul trebuie efectuat cu extracte de probe proaspăt preparate. După caz, se pot folosi și extracte conservate în soluție de glicerol la o temperatură cuprinsă
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
prepară folosindu-se una dintre următoarele metode: (i) Extracte concentrate cu relativ puțin amidon: Se pipetează un volum standard (15 f2μl este adecvat unui godeu de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru godeuri cu diametru mai mare) dintr-o diluție de 1/100 de sediment resuspendat în primul godeu. Apoi se pipetează un volum similar de sediment nediluat (1/1) în godeurile rămase din primul rând al lamei. Al doilea rând poate fi folosit ca duplicat sau pentru o a
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
de sediment nediluat (1/1) în godeurile rămase din primul rând al lamei. Al doilea rând poate fi folosit ca duplicat sau pentru o a doua probă, în conformitate cu cele indicate în figura 1. (îi) Pentru alte extracte concentrate: Se pregătesc diluții zecimale (1/10, 1/100) din sedimentul resuspendat în tampon concentrat. Se pipetează un volum standard (15 f2μl este adecvat unui godeu de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru godeuri cu un diametru mai mare) din sedimentul resuspendat și
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
10, 1/100) din sedimentul resuspendat în tampon concentrat. Se pipetează un volum standard (15 f2μl este adecvat unui godeu de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru godeuri cu un diametru mai mare) din sedimentul resuspendat și din fiecare diluție pe un rând de godeuri. Al doilea rând poate fi folosit ca duplicat sau pentru o a doua probă, în conformitate cu cele prezentate în figura 2. 5.2. Se lasă picăturile să se usuce la temperatura ambiantă sau prin încălzire la
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
într-o cutie uscată, atât cât este necesar (cel mult 3 luni), înainte de un nou test. 5.3. Procedura testului de imunofluorescență (i) În conformitate cu metoda de pregătire a lamelor-test indicată la pct. 5.1 (i): Se prepară un set de diluții de 1/2. În primul godeu diluția ar trebui să fie de 1/2 din titru (T/2), celelalte fiind de 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
necesar (cel mult 3 luni), înainte de un nou test. 5.3. Procedura testului de imunofluorescență (i) În conformitate cu metoda de pregătire a lamelor-test indicată la pct. 5.1 (i): Se prepară un set de diluții de 1/2. În primul godeu diluția ar trebui să fie de 1/2 din titru (T/2), celelalte fiind de 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T). (îi) În conformitate cu metoda de pregătire a
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
T/2), celelalte fiind de 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T). (îi) În conformitate cu metoda de pregătire a lamelor-test indicată la punctul 5.1(îi): Se prepară diluția de lucru a anticorpilor în tampon IF. Diluția de lucru are efect asupra specificității. Figura 1: Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct. 5.1 (i) și 5.3 (i) Diluții ale extractului concentrat resuspendat 1/100 1/1 1/1 1/1
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T). (îi) În conformitate cu metoda de pregătire a lamelor-test indicată la punctul 5.1(îi): Se prepară diluția de lucru a anticorpilor în tampon IF. Diluția de lucru are efect asupra specificității. Figura 1: Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct. 5.1 (i) și 5.3 (i) Diluții ale extractului concentrat resuspendat 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 Diluții ale extractului concentrat resuspendat (T
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
de pregătire a lamelor-test indicată la punctul 5.1(îi): Se prepară diluția de lucru a anticorpilor în tampon IF. Diluția de lucru are efect asupra specificității. Figura 1: Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct. 5.1 (i) și 5.3 (i) Diluții ale extractului concentrat resuspendat 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 Diluții ale extractului concentrat resuspendat (T = T/2 T/4 T/2 T 2T Diluții duble ale titru) antiserului/anticorpilor Figura 2: Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct.
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
a anticorpilor în tampon IF. Diluția de lucru are efect asupra specificității. Figura 1: Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct. 5.1 (i) și 5.3 (i) Diluții ale extractului concentrat resuspendat 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 Diluții ale extractului concentrat resuspendat (T = T/2 T/4 T/2 T 2T Diluții duble ale titru) antiserului/anticorpilor Figura 2: Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct. 5.1 (îi) și 5.3 (îi) Diluție de lucru a antiserului/anticorpilor Diluție zecimală
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct. 5.1 (i) și 5.3 (i) Diluții ale extractului concentrat resuspendat 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 Diluții ale extractului concentrat resuspendat (T = T/2 T/4 T/2 T 2T Diluții duble ale titru) antiserului/anticorpilor Figura 2: Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct. 5.1 (îi) și 5.3 (îi) Diluție de lucru a antiserului/anticorpilor Diluție zecimală a sedimentului resuspendat 1/1 1/10 1/100 gol gol 5.3.1
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
1 1/1 1/1 1/1 Diluții ale extractului concentrat resuspendat (T = T/2 T/4 T/2 T 2T Diluții duble ale titru) antiserului/anticorpilor Figura 2: Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct. 5.1 (îi) și 5.3 (îi) Diluție de lucru a antiserului/anticorpilor Diluție zecimală a sedimentului resuspendat 1/1 1/10 1/100 gol gol 5.3.1. Lamele se așază pe hârtie absorbantă umedă. Se acoperă complet fiecare godeu de test cu diluția sau diluțiile de
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
1 Diluții ale extractului concentrat resuspendat (T = T/2 T/4 T/2 T 2T Diluții duble ale titru) antiserului/anticorpilor Figura 2: Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct. 5.1 (îi) și 5.3 (îi) Diluție de lucru a antiserului/anticorpilor Diluție zecimală a sedimentului resuspendat 1/1 1/10 1/100 gol gol 5.3.1. Lamele se așază pe hârtie absorbantă umedă. Se acoperă complet fiecare godeu de test cu diluția sau diluțiile de anticorpi. Volumul de antiser pipetat în
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
5.3 (îi) Diluție de lucru a antiserului/anticorpilor Diluție zecimală a sedimentului resuspendat 1/1 1/10 1/100 gol gol 5.3.1. Lamele se așază pe hârtie absorbantă umedă. Se acoperă complet fiecare godeu de test cu diluția sau diluțiile de anticorpi. Volumul de antiser pipetat în fiecare godeu trebuie să fie cel puțin echivalent cu volumul de extract pipetat pe lamă. Următoarea procedură ar trebui aplicată în absența instrucțiunilor specifice ale furnizorilor de anticorpi: 5.3.2
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
îi) Diluție de lucru a antiserului/anticorpilor Diluție zecimală a sedimentului resuspendat 1/1 1/10 1/100 gol gol 5.3.1. Lamele se așază pe hârtie absorbantă umedă. Se acoperă complet fiecare godeu de test cu diluția sau diluțiile de anticorpi. Volumul de antiser pipetat în fiecare godeu trebuie să fie cel puțin echivalent cu volumul de extract pipetat pe lamă. Următoarea procedură ar trebui aplicată în absența instrucțiunilor specifice ale furnizorilor de anticorpi: 5.3.2. Se incubează
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
aerosoli sau transferul de picături care ar putea conduce la o contaminare încrucișată. Excesul de tampon IF se îndepărtează cu grijă cu o hârtie de filtru. 5.3.4. Lamele se așază pe hârtie umedă. Se acoperă godeurile lamelor-test cu diluții ale conjugatului FITC utilizat pentru determinarea titrului. Volumul de conjugat pipetat în godeuri trebuie să fie egal cu volumul de anticorpi pipetat. 5.3.5. Se incubează lamele pe hârtie umedă, acoperite, timp de 30 de minute la temperatura ambiantă
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
probele fără celule sau cu un număr redus de celule se examinează cel puțin 40 câmpuri microscopice. Se verifică mai întâi lama de control pozitiv. Celulele trebuie să fie intens fluorescente și colorate complet la titrul de anticorpi sau la diluția de lucru determinată. Testul IF (pct. 5) trebuie repetat în cazul în care apare o colorație anormală. 5.4.2. Se caută prezența celulelor intens fluorescente cu morfologie caracteristică bacteriei Ralstonia solanacearum în godeurile lamelor-test (vezi website-ul http://forum.europa
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
prezența celulelor intens fluorescente cu morfologie caracteristică bacteriei Ralstonia solanacearum în godeurile lamelor-test (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescenței trebuie să fie echivalentă cu cea a tulpinii de control pozitiv la aceeași diluție de anticorpi. Celulele cu colorație incompletă sau cu fluorescență slabă nu trebuie luate în considerare. În cazul în care se suspectează o contaminare, testul trebuie repetat. Acest lucru se poate întâmpla atunci când în toate lamele unei serii de analize se
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
punct de vedere morfologic, precum și bacterii saprofite care pot conduce la reacții încrucișate, având mărime și morfologie asemănătoare cu Ralstonia solanacearum. 5.4.4. Trebuie luate în considerare numai celulele fluorescente ale căror dimensiune și morfologie sunt caracteristice titrului sau diluției de lucru a anticorpilor menționați la pct. 5.3. 5.4.5. Interpretarea testului IF: (i) În cazul în care se observă celule intens fluorescente cu morfologie caracteristică, se determină numărul mediu de celule tipice pe câmp microscopic și se
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
ADN-ului din controalele pozitive cu un conținut de 10^3-10^4 celule patogene per ml. 6.2. Amplificare PCR 6.2.1. Se pregătesc extractele de ADN de testat și controalele în conformitate cu protocoalele validate (pct. 6). Se prepară o diluție decimală din extractul de probă de ADN (1:10 în apă ultrapură). 6.2.2. Se prepară amestecul reactiv (mixul de amplificare) corespunzător pentru PCR într-un mediu necontaminat în conformitate cu protocoalele publicate (apendice 6). În cazul în care este posibil
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]
-
PB 0,01 M (a se vedea apendicele 7). 7.1.5. Se pipetează 16 f2μl din suspensiile fixate pe o lamă multitest curată, în conformitate cu figura 7.1. Pe fiecare lamă se pipetează două probe diferite, nediluate, și 10 f2μl diluție de 1:100 ale acestora (într-un tampon fosfat 0,01 M). Restul suspensiei (49 f2μl) poate fi conservată la - 20°C după ce i s-a adăugat un volum de etanol de 96 %. În cazul în care testul FISH trebuie
ORDIN nr. 586 din 13 iulie 2007 privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.. In: EUR-Lex () [Corola-website/Law/189771_a_191100]