13,026 matches
-
fie definită în mod clar în modelul predictiv înainte de validarea metodei, iar studiul ulterior de validare trebuie să demonstreze că valoarea prag este corespunzătoare (2). 3. RAPORTAREA Raportul testului Raportul testului trebuie să includă cel puțin următoarele informații: Substanța de testat - datele de identificare, natura fizică și, dacă este relevant, proprietățile fizico-chimice. Informații similare ar trebui să se ofere pentru substanțele de referință, dacă s-au utilizat. Condițiile de testare: - detalii privind modul de lucru, - descrierea și justificarea oricăror modificări. Rezultatele
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
Condițiile de testare: - detalii privind modul de lucru, - descrierea și justificarea oricăror modificări. Rezultatele: - prezentarea sub formă de tabele a valorilor rezistenței (testul RET) sau a valorilor viabilității celulare în procente (testul cu model de piele umană) pentru materialul de testat, martorii pozitiv și negativ și orice substanță chimică etalon de referință, inclusiv datele pentru experimentele concomitente/repetate și valorile medii, - descrierea oricăror altor efecte observate. Discutarea rezultatelor Concluzii 4. BIBLIOGRAFIA (1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, pp. 275-280
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
de o expunere la lumină, sau care este indusă în mod similar prin iradierea pielii după administrarea sistemică a unui produs chimic. Informațiile obținute din testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro permit determinarea potențialului fototoxic al unei substanțe de testat, adică posibilele pericole (sau absența acestora) pe care ar putea să le prezinte o substanță de testat în caz de expunere la lumină UV sau vizibilă. Deoarece finalitatea toxicologică a testului in vitro constă în determinarea fototoxicității, indusă prin acțiunea
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
sistemică a unui produs chimic. Informațiile obținute din testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro permit determinarea potențialului fototoxic al unei substanțe de testat, adică posibilele pericole (sau absența acestora) pe care ar putea să le prezinte o substanță de testat în caz de expunere la lumină UV sau vizibilă. Deoarece finalitatea toxicologică a testului in vitro constă în determinarea fototoxicității, indusă prin acțiunea combinată a unui produs chimic și a luminii, prin prezentul test este posibilă determinarea compușilor care sunt
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
și la un produs chimic. Termenul "fotococarcinogenitate" se utilizează atunci când efectul tumorigen indus de UV este accentuat de expunerea la un produs chimic. 1.3. Substanțe dereferință În afară de substanței chimice clorpromazină utilizate ca martor pozitiv, care ar trebui să fie testată în paralel ca substanță de referință în fiecare test, pentru reînnoirea testului de fototoxicitate 3T3 NRU se recomandă utilizarea ca substanțe de referință a unei subgrupe de produse chimice utilizate în experimentele interlaboratoare la prezentul test (1) (3) (13). 1
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
absorbită de un cromofor (chimic) poate antrena o reacție fototoxică (7). Toate aceste mecanisme conduc la o degradare celulară. Prin urmare, testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro se întemeiază pe o comparare a citotoxicității unui produs chimic atunci când este testat cu expunere sau fără expunere la o doză necitotoxică de lumină UVA/vizibilă. În prezentul test, citotoxicitatea se exprimă printr-o diminuare, dependentă de concentrație, a colorantului vital roșu neutru (NR) fixat (9) după 24 de la tratarea cu produsul chimic
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
concentrație, a colorantului vital roșu neutru (NR) fixat (9) după 24 de la tratarea cu produsul chimic testat și iradierea acestuia. Celulele Balb/c 3T3 sunt păstrate în cultură timp de 24 ore pentru formarea monostraturilor. Pentru fiecare produs chimic de testat, câte două plăci cu 96 de cavități se supun la preincubare cu opt concentrații diferite ale produsului chimic timp de 1 oră. Apoi, una dintre cele două plăci este expusă la o doză de lumină UVA/vizibilă necitotoxică, de 5
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
un produs chimic fototoxic cunoscut se supune testării în paralel cu fiecare test de fototoxicitate 3T3 NRU. Clorpromazina (CPZ) s-a utilizat ca probă martor pozitivă în studiul de validare UE/COLIPA și prin urmare este cea recomandată. Pentru CPZ, testată conform protocolului standard în testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro, s-au stabilit următoarele criterii de acceptare a testului: CPZ iradiată (+UVA): EC50= 0,1 -2,0 μg/ml, CPZ neiradiată (-UVA): EC50= 7,0 - 90,0 μg/ml
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
0,1 -2,0 μg/ml, CPZ neiradiată (-UVA): EC50= 7,0 - 90,0 μg/ml. Factorul de fotoiritare (PIF), adică variația EC50 ar trebui să fie de cel puțin 6. În locul CPZ, se pot utiliza ca probe martor pozitive, testate în paralel, alte produse chimice fototoxice cunoscute, ce corespund clasei de produse chimice sau caracteristicilor de solubilitate ale produselor chimice de testat. În acest caz, în funcție de datele anterioare, se recomandă stabilirea specifică a limitelor pentru valorile EC50 și a PIF
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
EC50 ar trebui să fie de cel puțin 6. În locul CPZ, se pot utiliza ca probe martor pozitive, testate în paralel, alte produse chimice fototoxice cunoscute, ce corespund clasei de produse chimice sau caracteristicilor de solubilitate ale produselor chimice de testat. În acest caz, în funcție de datele anterioare, se recomandă stabilirea specifică a limitelor pentru valorile EC50 și a PIF sau MPE (fotoefectul mediu) drept criterii de acceptare pentru test. 1.7. Descrierea metodei de testare 1.7.1. Preparatele 1.7
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
testat trebuie să fie proaspăt preparate chiar înaintea utilizării, cu excepția cazului în care datele de stabilitate dovedesc o conservare care poate să fie acceptată. Atunci când este posibilă o fotodegradare rapidă, poate fi necesară prepararea în lumină roșie. Produsele chimice de testat ar trebui să fie dizolvate în soluții saline tamponate, de ex. soluție salină echilibrată Earl (EBSS) sau soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), care, pentru a evita interferența în timpul iradierii, nu trebuie să conțină componente proteinice și indicatori de pH
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
saline tamponate, de ex. soluție salină echilibrată Earl (EBSS) sau soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), care, pentru a evita interferența în timpul iradierii, nu trebuie să conțină componente proteinice și indicatori de pH colorați care absorb lumina. Produsele chimice de testat cu solubilitate limitată în apă ar trebui să fie dizolvate în solvenți corespunzători la concentrații de 100 de ori mai mari decât cele dorite în final și soluțiile obținute să fie apoi diluate 1:100 cu soluție salină tamponată. Dacă
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
apoi diluate 1:100 cu soluție salină tamponată. Dacă se utilizează un solvent, acesta trebuie să fie prezent în volum constant de 1% (volum/volum) în toate culturile, adică în probele martor negative, precum și în toate concentrațiile produsului chimic de testat. Solvenții recomandați sunt dimetilsulfoxidul (DMSO) și etanolul (EtOH). Pot să fie corespunzători și alți solvenți cu citotoxicitate redusă (de ex. acetona), dar se recomandă o evaluare atentă a proprietăților specifice ale acestora, de ex. reacția cu produsul chimic de testat
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
testat. Solvenții recomandați sunt dimetilsulfoxidul (DMSO) și etanolul (EtOH). Pot să fie corespunzători și alți solvenți cu citotoxicitate redusă (de ex. acetona), dar se recomandă o evaluare atentă a proprietăților specifice ale acestora, de ex. reacția cu produsul chimic de testat, atenuarea efectului fototoxic, proprietățile de fixare a radicalilor. Pentru facilitarea solubilizării, se pot utiliza agitatorul Vortex și/sau sonicarea și/sau încălzirea până la 37oC. 1.7.1.6. Iradierea UV/prepararea Sursa de lumină: alegerea unei surse de lumină corespunzătoare
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
de o mie de ori de la 313 nm la 280 nm (11). Criteriile pentru alegerea unei surse corespunzătoare de lumină ar trebui să includă cerința esențială ca sursa de lumină să emită lungimile de undă absorbite de produsul chimic de testat și ca doza de lumină (care se poate obține într-un timp rezonabil) să fie suficientă pentru detectarea substanțelor fotosensibilizante cunoscute. În plus, lungimile de undă și dozele utilizate nu ar trebui să dăuneze în mod nejustificat sistemului, în special
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
să fie nocivă pentru celule, dar să fie suficientă pentru detectarea fototoxinelor standard. Timpul de expunere la lumină se calculează cu următoarea relație: (1 J = 1 W sec) 1.7.2. Condițiile de testare Concentrația maximă a produsului chimic de testat nu trebuie să fie mai mare de 100 μg/ml, deoarece toate produsele chimice fotoxice au fost detectate la concentrații mai mici, în timp ce la concentrații mai mari, crește incidența rezultatelor fals pozitive (supraestimărilor) (13). PH-ul la concentrațiile cele mai
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
mare de 100 μg/ml, deoarece toate produsele chimice fotoxice au fost detectate la concentrații mai mici, în timp ce la concentrații mai mari, crește incidența rezultatelor fals pozitive (supraestimărilor) (13). PH-ul la concentrațiile cele mai mari ale produsului chimic de testat ar trebui să fie satisfăcător (limitele pH-ului: 6,5-7,8). Limitele concentrațiilor unui produs chimic testat în prezența (+UVA) și în absența (-UVA) luminii ar trebui să fie determinate în mod specific prin încercări prealabile. Limitele și intervalele unei
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
în timp ce la concentrații mai mari, crește incidența rezultatelor fals pozitive (supraestimărilor) (13). PH-ul la concentrațiile cele mai mari ale produsului chimic de testat ar trebui să fie satisfăcător (limitele pH-ului: 6,5-7,8). Limitele concentrațiilor unui produs chimic testat în prezența (+UVA) și în absența (-UVA) luminii ar trebui să fie determinate în mod specific prin încercări prealabile. Limitele și intervalele unei serii de concentrații se reglează, astfel încât datele experimentale să confirme în mod satisfăcător curbele concentrație-răspuns. Ar trebui
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
zi După incubare, se decantează mediul de cultură de celule și se spală de două ori cu 150 μl de EBSS/PBS pentru fiecare cavitate. Se adaugă 100 μl de EBSS/PBS ce conțin concentrația corespunzătoare a produsului chimic de testat sau doar solvent (martorul negativ). Se aplică 8 concentrații diferite de produs chimic de testat. Se incubează celulele cu produsul chimic de testat la întuneric timp de 60 de minute (7,5% CO2, 37oC). Pentru a realiza partea (+UVA) a
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
ori cu 150 μl de EBSS/PBS pentru fiecare cavitate. Se adaugă 100 μl de EBSS/PBS ce conțin concentrația corespunzătoare a produsului chimic de testat sau doar solvent (martorul negativ). Se aplică 8 concentrații diferite de produs chimic de testat. Se incubează celulele cu produsul chimic de testat la întuneric timp de 60 de minute (7,5% CO2, 37oC). Pentru a realiza partea (+UVA) a testului, se iradiază celulele la temperatura camerei timp de 50 de minute, prin capacul plăcii
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
fiecare cavitate. Se adaugă 100 μl de EBSS/PBS ce conțin concentrația corespunzătoare a produsului chimic de testat sau doar solvent (martorul negativ). Se aplică 8 concentrații diferite de produs chimic de testat. Se incubează celulele cu produsul chimic de testat la întuneric timp de 60 de minute (7,5% CO2, 37oC). Pentru a realiza partea (+UVA) a testului, se iradiază celulele la temperatura camerei timp de 50 de minute, prin capacul plăcii cu 96 de cavități, cu 1,7 mW
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
să nu fie citotoxic până la concentrația limită determinată de 100 μg/ml, dar foarte citotoxic atunci când este iradiat (+UVA), s-ar putea să fie necesară o variație cu câteva ordine de mărime a gamei de concentrații ce urmează să fie testate în ambele părți ale experimentului, pentru îndeplinirea cerințelor de calitate a datelor specifice. Dacă nu se constată citotoxicitate în ambele părți ale experimentului (-UVA și +UVA), este suficient să se realizeze testul cu un interval mare între fiecare doză până la
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
realizeze testul cu un interval mare între fiecare doză până la concentrația maximă. Nu se cere verificarea unui rezultat clar pozitiv prin repetarea experimentului. În plus, rezultatele clar negative nu trebuie verificate, cu condiția ca produsul chimic respectiv să fi fost testat în concentrații suficient de mari. În aceste cazuri, este suficient un singur experiment principal, susținut de una sau mai multe experimente preliminare pentru determinarea gamei de concentrații. Testele cu rezultate la limită, aproape de pragul critic al modelului predictiv, ar trebui
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
repetarea testului. O altă posibilitate ar fi variația timpului de incubare, preiradiere. Un timp mai scurt poate să fie relevant pentru produsele chimice instabile în apă. 2.2. Prezentarea datelor Dacă este posibil, se determină concentrația unui produs chimic de testat care reflectă o inhibare cu 50% a fixării roșului neutru de către celule (EC50). Acest lucru se poate realiza prin aplicarea unei metode de regresie neliniară corespunzătoare (de preferință o funcție Hill sau o regresie logistică) pentru prelucrarea datelor de concentrație-răspuns
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]
-
de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro (PIF < 5 sau MPE < 0,1) indică faptul că substanța testată nu este fototoxică pentru cultura de celule de mamifere în condițiile utilizate. În cazurile în care este posibil ca produsul chimic să fie testat până la concentrația maximă de 100μg/ml, un rezultat negativ indică faptul că produsul chimic nu are potențial fototoxic și că o fototoxicitate in vivo se poate considera ca fiind improbabilă. În cazurile în care s-au obținut răspunsuri concentrație-toxicitate (EC50
jrc4584as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89750_a_90537]