12,664 matches
-
pe secvențe repetitive [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al, 1995; Smith et al, 1995)] 4.3 Testul de patogenicitate Acesta este un test pentru confirmarea diagnosticului de Ralstonia solanacearum și pentru evaluarea virulenței culturilor identificate ca fiind Ralstonia solanacearum. Se prepară un inocul de 106 celule pe ml din cultură și dintr-o sușă de control pozitiv. Se inoculează 5- 10 plante de tomată sau vinete, preferabil la nivelul celei de a treia frunze adevărate sau mai bătrâne (secțiunea III.6
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
de preferință cu 10 ferestre de minim 6 mm diametru. Pe fiecare lamă de test se include un control FITC conjugat. Testul ar trebui repetat cu includerea unui control PBS, dacă este observată o celulă pozitivă la controlul FITC. Se prepară lame de control pozitiv separate cu o suspensie de 106 celule pe ml dintr-o sușă corespunzătoare de rasă / biovar de Ralstonia solanacearum. Se utilizează o lamă la fiecare set de teste. 2.1. Lamele de test se prepară printr-
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
Se prepară lame de control pozitiv separate cu o suspensie de 106 celule pe ml dintr-o sușă corespunzătoare de rasă / biovar de Ralstonia solanacearum. Se utilizează o lamă la fiecare set de teste. 2.1. Lamele de test se prepară printr-una dintre următoarele proceduri: (i) pentru extracte concentrate cu relativ puțin amidon: Se pipetează un volum standard (15 μl este adecvat unei ferestre de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru ferestre mai mari) din extractul concentrat resuspendat într-
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
2. 2.2. Se lasă picăturile să se usuce. Celulele bacteriene se fixează pe lamă prin încălzire, trecere prin flacără sau cu 95% etanol. 2.3 Procedura IF (i) În conformitate cu pregătirea lamei de test de la 2.1 pct. (i): se prepară un set de diluții duble ale antiserului în tampon IF (apendicele 3): 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T). (ii) În conformitate cu pregătirea lamei de test de la 2
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
duble ale antiserului în tampon IF (apendicele 3): 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T). (ii) În conformitate cu pregătirea lamei de test de la 2.1 pct. (ii): se prepară diluția de lucru (WD) a antiserului în tampon IF. Diluția de lucru este diluția antiserului cu specificitate optimă și este de obicei jumătate din titru. Figura 1 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (i) și 2.3 pct.
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
37 șC sau peste noapte la 4 șC. 3.4. Se scot extractele din puțuri. Se spală puțurile de trei ori cu PBS - Tween (apendicele 5), lăsând ultima soluție de spălare cel puțin cinci minute în puțuri. 3.5. Se prepară diluția corespunzătoare a antiserului de Ralstonia solanacearum în tampon de blocare (apendicele 5). Se aplică 100 μl de diluție de antiser în puțuri. Se incubează o oră la 37 șC. 3.6. Se scoate antiserul din puțuri. Se spală ca
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
în tampon de blocare (apendicele 5). Se aplică 100 μl de diluție de antiser în puțuri. Se incubează o oră la 37 șC. 3.6. Se scoate antiserul din puțuri. Se spală ca mai înainte (3.4). 3.7. Se prepară diluția corespunzătoare de conjugat de fosfatază alcalină în tampon de blocare. Se aplică 100 μl de diluție conjugată în puțuri. Se incubează o oră la 37 șC. 3.8. Se scoate conjugatul din puțuri. Puțurile se spală ca mai înainte
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
tampon de blocare. Se aplică 100 μl de diluție conjugată în puțuri. Se incubează o oră la 37 șC. 3.8. Se scoate conjugatul din puțuri. Puțurile se spală ca mai înainte (3.4 și 3.6). 3.9. Se prepară soluția de substrat de fosfatază alcalină (apendicele 5). Se aplică 100 μl în puțuri. Se incubează timp de 30 de minute până la o oră în întuneric la temperatura camerei. 3.10. Se citește absorbanța la 409 nm. Interpretarea testului ELISA
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
a eșantionului este > 2 × DO a controlului negativ. 4. Testul PCR În baza Seal et al., 1993 Notă: În timpul tuturor etapelor de pregătire a eșantioanelor și a altor manipulări care implică PCR trebuie folosite conuri de pipetă cu filtru. Se prepară o suspensie de 106 celule pe ml dintr-o sușă din rasa 3 / biovar 2 de Ralstonia solanacearum drept control pozitiv. Se testează într-un mod identic cu eșantionul sau eșantioanele. 4.1. Se pipetează 100 μl din extractul concentrat
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
concentrat resuspendat într-o microfiolă conținând 10 μl de 0,5M de NaOH. Se amestecă întorcând în mod repetat microfiola. 4.2. Se încălzește timp de 4 minute la 100 șC. Se pune imediat microfiola la gheață. 4.3. Se prepară cel puțin două soluții decimale, de exemplu 1/10 și 1/100 sau mai multe dacă se consideră util, în apă distilată sterilă sau ultrapură (AUP). 4.4. Se prepară amestecul de reacție PCR (apendicele 6) într-o fiolă sterilă
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
șC. Se pune imediat microfiola la gheață. 4.3. Se prepară cel puțin două soluții decimale, de exemplu 1/10 și 1/100 sau mai multe dacă se consideră util, în apă distilată sterilă sau ultrapură (AUP). 4.4. Se prepară amestecul de reacție PCR (apendicele 6) într-o fiolă sterilă, prin adăugarea următoarelor componente în ordinea următoare: Pentru un volum de reacție de 50 μl: Component Cantitate Concentrație finală Apă distilată sterilă sau AUP 30,8 μl - 33,8 μl
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
dacă se folosesc în aceeași zi, și la -18°C pentru o durată mai mare. 4.6. Analiza produsului PCR Fragmentele PCR se detectează prin electroforeză în gel de agar și colorare cu bromură de etidiu. 4.6.1. Se prepară un mediu agarizat corespunzător aducând încet la fierbere agaroza în tampon de electroforeză tri-acetată (ETA). 4.6.2 Se răcește agaroza topită la 50 - 60 °C, se toarnă în cuva electroforezei și se introduce pieptenul. Soluția se lasă să se
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
fragmentul amplificat este identic cu sușa de control pozitiv de Ralstonia solanacearum. 5. Testul de placare selectivă În baza Elphinstone et al., 1996 5.1 Testul se efectuează printr-o tehnică corespunzătoare de diluare galvano-plastică, cum ar fi: (i) Se prepară cel puțin două diluții zecimale, 1/10 și 1/100 sau mai multe, dacă se consideră util, din extractul concentrat resuspendat în tamponul de concentrare. Se pipetează un volum standard măsurat (50 - 100 μl) din extractul concentrat resuspendat și fiecare
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
sau testul PCR (prezenta secțiune, 4.). 8. Testul de patogenicitate A se vedea secțiunea II, 4.3. Apendicele 1 Medii nutritive pentru izolarea și cultura Ralstonia solanacearum Agar nutritiv (AN) Agar nutritiv (Difco) 23 g Apă distilată 1 litru Se prepară volume de 1/2 litri de mediu în flacoane de 1 litru. Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavizare la 121° C timp de 15 minute. Se răcește la 50 °C. Se toarnă pe plăci. Mediu drojdie - peptonă - glucoză - agar
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
minute. Se răcește la 50 °C. Se toarnă pe plăci. Mediu drojdie - peptonă - glucoză - agar (YPGA) Extract de levură (Difco) 5 g Bacto-peptonă (Difco) 5 g D(+) glucoză (monohidrat) 10 g Bacto-geloză (Difco) 15 g Apă distilată 1 litru Se prepară volume de 1/2 litri de mediu în flacoane de 1 litru. Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavizare la 121°C timp de 15 minute. Se răcește la 50°C. Se toarnă pe plăci. Mediu zaharoză - peptonă-agar (SPA) Zaharoză
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
de 15 minute. Se răcește la 50°C. Se toarnă pe plăci. Mediu zaharoză - peptonă-agar (SPA) Zaharoză 20 g Peptonă 5 g K2HPO4 0,5 g MgSO4·7H2O 0,25 g Bacto-geloză (Difco) 15 g Apă distilată 1 litru Se prepară volume de 1/2 litri de mediu în flacoane de 1 litru. Se dizolvă ingredientele. Se ajustează la pH 7,2 - 7,4, dacă este necesar. Se sterilizează prin autoclavizare la 121 °C timp de 15 minute. Se răcește la
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
121 °C timp de 15 minute. Se răcește la 50 °C. Se toarnă pe plăci. Mediul de tetrazoliu Kelman Acizi casaminici (Difco) 1 g Bacto-peptonă (Difco) 10 g Dextroză 5 g Bacto-geloză (Difco) 15 g Apă distilată 1 litru Se prepară volume de 1/2 litri de mediu în flacoane de 1 litru. Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavizare la 121 °C timp de 15 minute. Se răcește la 50 °C. Se adaugă o soluție apoasă sterilizată prin filtrare de
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
Engelbrecht, 1994 modificat de Elphinstone et al, 1996) dar se elomină geloza și sărurile de tetrazoliu. Mediu de bază Acizi casaminici (Difco) 1 g Bacto-peptonă (Difco) 10 g Glicerol 5 ml Geloză (Difco) 15 g Apă distilată 1 litru Se prepară volume de 1/2 litri de mediu în flacoane de 1 litru. Se dizolvă ingredientele și se verifică pH-ul. Se ajustează pH-ul, dacă este necesar, la 6,5 înainte de autoclavizare. Ralstonia solanacearum nu se dezvoltă bine într-un
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
tetrazoliu 50 mg la litru Se dizolvă ingredientele în 70% etanol la concentrațiile date pentru volumul de mediu preparat. Unele ingrediente ca polimixina B și cloramfenicolul necesită o ușoară încălzire și agitare. Mediu nutritiv SMSA (Elphinstone et al., 1996) Se prepară ca și pentru mediul selectiv SMSA, dar se elimină geloza. Se împarte în alicote de 3 ml în tuburi de unică folosință Universal de 30 ml. Bibiografie Buddenhagen, I.W.; Sequeira, L. and Kelman, A. 1962. Description of races in
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
42 10 (a) - - - din specia porcinelor domestice - - altele, inclusiv amestecuri: 1602 49 11 (a) - - - din specia porcinelor domestice 1602 49 13 (a) 1602 49 15 (a) 1602 49 19 (a) 1602 49 30 (a) 1602 49 50 (a) - altele inclusiv preparate din sânge de orice animal - - Preparate din sânge de orice animal: ex 1602 90 10 (b) - - - Preparate din sânge de vită și de porc - - altele - - - altele: 1602 90 51 (a) - - - - cu conținut de carne sau măruntaie de porcine domestice Alte
jrc3754as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88915_a_89702]
-
domestice - - altele, inclusiv amestecuri: 1602 49 11 (a) - - - din specia porcinelor domestice 1602 49 13 (a) 1602 49 15 (a) 1602 49 19 (a) 1602 49 30 (a) 1602 49 50 (a) - altele inclusiv preparate din sânge de orice animal - - Preparate din sânge de orice animal: ex 1602 90 10 (b) - - - Preparate din sânge de vită și de porc - - altele - - - altele: 1602 90 51 (a) - - - - cu conținut de carne sau măruntaie de porcine domestice Alte zaharuri, inclusiv lactoza, maltoza, glucoza și
jrc3754as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88915_a_89702]
-
domestice 1602 49 13 (a) 1602 49 15 (a) 1602 49 19 (a) 1602 49 30 (a) 1602 49 50 (a) - altele inclusiv preparate din sânge de orice animal - - Preparate din sânge de orice animal: ex 1602 90 10 (b) - - - Preparate din sânge de vită și de porc - - altele - - - altele: 1602 90 51 (a) - - - - cu conținut de carne sau măruntaie de porcine domestice Alte zaharuri, inclusiv lactoza, maltoza, glucoza și fructoza (levuloza) chimic pure, în stare solidă; siropuri din zahăr fără
jrc3754as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88915_a_89702]
-
Sirop de inulină 1702 90 99 (a) - - altele Preparate alimentare nenominalizate și neincluse altundeva: - altele: - - Siropuri din zahăr, aromatizate sau cu adaos de coloranți: 2106 90 30 (a) - - - izoglucoză - - - altele: 2106 90 51 (a) - - - - lactoză 2106 90 59 (a) - - - - altele Preparate tip utilizate în alimentația animalelor: - Alimente pentru câini sau pisici ambalate pentru vânzarea cu amănuntul: - - conținând amidon, glucoză, maltodextrină sau sirop de maltodextrină de la subpozițiile 1702 30 51 până la 1702 30 99, 1702 40 90, 1702 90 50, 2106 90
jrc3754as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88915_a_89702]
-
care fac obiectul supravegherii comunitare Descrierea produsului codul HS/CN Clorură de amoniu 2827 10 Alți alcooli polihidrici 2905 49 90 Acid citric 2918 14 Tetracicline și derivații acestora ex 2941 30 Cloramfenicol ex 2941 40 Coloranți de bază și preparate pe baza acestora 3204 13 Coloranți de cadă și preparate pe baza acestora 3204 15 Artificii, semnale luminoase de avertizare, rachete pentru ploaie, semnale pentru ceață și alte articole pirotehnice 3604 Polivinil alcool 3905 30 Mănuși 4203 29 91 4203
jrc3793as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88955_a_89742]
-
Clorură de amoniu 2827 10 Alți alcooli polihidrici 2905 49 90 Acid citric 2918 14 Tetracicline și derivații acestora ex 2941 30 Cloramfenicol ex 2941 40 Coloranți de bază și preparate pe baza acestora 3204 13 Coloranți de cadă și preparate pe baza acestora 3204 15 Artificii, semnale luminoase de avertizare, rachete pentru ploaie, semnale pentru ceață și alte articole pirotehnice 3604 Polivinil alcool 3905 30 Mănuși 4203 29 91 4203 29 99 Încălțăminte 6402 19 ex 6402 991 6403 19
jrc3793as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88955_a_89742]