13,026 matches
-
sau metaboliții acesteia să ajungă în circulația generală sau în mod specific în țesutul-țintă (de ex. toxicitatea sistemică). 3. RAPORTAREA RAPORTUL TESTULUI Raportul testului ar trebui să conțină următoarele informații: Solventul/vehiculul: - justificarea alegerii vehiculului, - solubilitatea și stabilitatea substanței de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaște. Animalele de laborator: - specia/sușa utilizată, - numărul, vârsta și sexul animalelor, - sursa, condițiile de adăpost și hrană etc., - greutatea fiecărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul de greutate, greutatea medie și deviația standard pentru
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
inclusiv intervalul de greutate, greutatea medie și deviația standard pentru fiecare grupă. Condițiile de testare: - martorii pozitivi și negativi (solvent/vehicul), - datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dacă s-a realizat, - justificarea alegerii dozelor utilizate, - detalii privind prepararea substanței de testat, - detalii privind administrarea substanței de testat, - justificarea căii de administrare selectate, - metodele de verificare pentru a constata dacă substanța de testat a ajuns în circulația generală sau în țesutul-țintă, dacă este cazul, - conversia concentrației substanței de testat (ppm) în hrană
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
și deviația standard pentru fiecare grupă. Condițiile de testare: - martorii pozitivi și negativi (solvent/vehicul), - datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dacă s-a realizat, - justificarea alegerii dozelor utilizate, - detalii privind prepararea substanței de testat, - detalii privind administrarea substanței de testat, - justificarea căii de administrare selectate, - metodele de verificare pentru a constata dacă substanța de testat a ajuns în circulația generală sau în țesutul-țintă, dacă este cazul, - conversia concentrației substanței de testat (ppm) în hrană/apa de băut în doza reală
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
există agenți cancerigeni care nu se detectează cu prezentul test, deoarece acționează prin alte mecanisme negenotoxice sau mecanisme care nu sunt prezente în celulele bacteriene. 1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE Suspensiile de celule bacteriene sunt expuse la substanța de testat în prezența și în absența unui sistem exogen de activare metabolică. În procedeul de încorporare prin depunere pe o placă, suspensiile menționate se amestecă cu o geloză de acoperire (agar) și se depun imediat pe un mediu minimal. În procedeul
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
Vogel-Bonner și glucoză) și o geloză de acoperire care conține histidină și biotin sau triptofan pentru a permite divizarea doar a unui număr mic de celule (1) (2) (9). 1.5.1.3. Activarea metabolică Expunerea bacteriilor la substanța de testat ar trebui să se realizeze atât în prezența, cât și în absența unui sistem corespunzător de activare metabolică. Sistemul utilizat cel mai frecvent conține o fracție post mitocondrială îmbogățită cu un cofactor (S9), preparată din ficat de rozătoare tratat cu
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
și β-naftoflavonă (18) (20) (21). Fracția postmitocondrială se utilizează, de obicei, la concentrații cuprinse între 5 și 30% vol./ vol. în amestecul S9. Alegerea și compoziția unui sistem de activare metabolică pot să depindă de clasa chimică a substanței de testat. În unele cazuri, s-ar putea să fie convenabilă utilizarea mai multor concentrații ale fracției postmitocondriale. Pentru coloranții azoici și diazoderivați, s-ar putea să fie mai potrivită utilizarea unui sistem de activare metabolică reducător (6) (13). 1.5.1
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
fie convenabilă utilizarea mai multor concentrații ale fracției postmitocondriale. Pentru coloranții azoici și diazoderivați, s-ar putea să fie mai potrivită utilizarea unui sistem de activare metabolică reducător (6) (13). 1.5.1.4. Substanța de testat/prepararea Substanțele de testat în stare solidă ar trebui să se prepare sub formă de soluții sau suspensii în solvenții sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului bacteriilor. Substanțele de testat lichide se pot adăuga direct în sistemele de testare
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
5.1.4. Substanța de testat/prepararea Substanțele de testat în stare solidă ar trebui să se prepare sub formă de soluții sau suspensii în solvenții sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului bacteriilor. Substanțele de testat lichide se pot adăuga direct în sistemele de testare și/sau se diluează înainte de utilizare în tratamentul bacteriilor. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanță de testat, cu excepția cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului bacteriilor. Substanțele de testat lichide se pot adăuga direct în sistemele de testare și/sau se diluează înainte de utilizare în tratamentul bacteriilor. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanță de testat, cu excepția cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare. Solventul/vehiculul nu ar trebui să reacționeze chimic cu substanța de testat și nu ar trebui să afecteze supraviețuirea bacteriilor și activitatea S9 (22). Utilizarea
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
înainte de utilizare în tratamentul bacteriilor. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanță de testat, cu excepția cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare. Solventul/vehiculul nu ar trebui să reacționeze chimic cu substanța de testat și nu ar trebui să afecteze supraviețuirea bacteriilor și activitatea S9 (22). Utilizarea altor solvenți/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
bacteriilor și activitatea S9 (22). Utilizarea altor solvenți/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere utilizarea unui solvent/vehicul apos. Când se testează substanțe instabile în apă, solventul organic utilizat ar trebui să nu conțină apă. 1.5.2. Condițiile de testare 1.5.2.1. Sușele experimentale (vezi 1.5.1.1) 1.5.2.2. Concentrația de expunere Printre criteriile care
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
conțină apă. 1.5.2. Condițiile de testare 1.5.2.1. Sușele experimentale (vezi 1.5.1.1) 1.5.2.2. Concentrația de expunere Printre criteriile care trebuie luate în considerație la determinarea cantității maxime de substanță de testat ce urmează se utilizeze sunt citotoxicitatea și solubilitatea în amestecul final de tratare. Ar putea fi util un test preliminar pentru determinarea toxicității și caracteristicilor de solubilitate. Detectarea citotoxicității poate fi posibilă printr-o reducere a numărului de colonii care
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
solubile este de 5 mg/placă sau 5μl/placă. Pentru substanțele necitotoxice insolubile la 5mg/placă sau 5μl/placă, una sau mai multe din concentrațiile de testare ar trebui să fie insolubile în amestecul final de tratament. Pentru substanțele de testat care sunt deja citotoxice la concentrații mai mici de 5 mg/placă sau 5μl/placă, testarea ar trebui să se realizeze până la o concentrație citotoxică. Ar trebui ca precipitatul să nu interfereze cu evaluarea rezultatelor. Într-un test inițial, se
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
substanțe de referință ca martori pozitivi corespunzători. Ar trebui să se aibă în vedere utilizarea unor martori pozitivi din aceeași clasă chimică, dacă sunt disponibili. Ar trebui să se utilizeze martori negativi, constituiți din solvent sau vehicul fără substanța de testat, dar tratați în același mod ca grupele cu tratament. În plus, ar trebui să se utilizeze și martori netratați, cu excepția cazului în care există date din testele anterioare care să ateste că solventul ales nu are efecte dăunătoare sau mutagene
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
mutagene. 1.5.3. Modul de lucru Pentru metoda de încorporare prin depunere pe o placă (1) (2) (3) (4), fără activare metabolică, se prepară, de obicei, un amestec din 0,05 ml sau 0,1 ml de soluție de testat, 0,1 ml de cultură bacteriană proaspătă (ce conține aproximativ 108 celule viabile) și 0,5 ml de tampon steril cu 2,0 ml geloză de acoperire (agar). Pentru testul cu activare metabolică, se prepară, de obicei, un amestec din
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
ml preparat de activare metabolică, ce conține o cantitate specifică de fracție postmitocondrială (în proporție de 5 până la 30% vol./ vol. în preparatul de activare metabolică), 2,0 ml de geloză de acoperire, bacterii și substanța de testat/soluția de testat. Conținutul din fiecare eprubetă se agită și se toarnă pe suprafața unui mediu minimal de geloză depus pe placă. Geloza de acoperire se lasă să se solidifice înainte de incubare. Pentru metoda de preincubare (2) (3) (5) (6), substanța de testat
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
mult, la 30-37oC, înainte de a fi amestecată cu geloza de acoperire și turnată pe suprafața unui mediu minimal de geloză depus pe placă. De obicei, se prepară un amestec din 0,05 ml sau 0,1 ml de substanță de testat/soluție de testat, 0,1 ml bacterii și 0,5 ml amestec S9 sau tampon steril cu 2,0 ml geloză de acoperire. Eprubetele ar trebui să fie aerate cu ajutorul unui agitator în timpul preincubării. Pentru o bună estimare a variației
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
înainte de a fi amestecată cu geloza de acoperire și turnată pe suprafața unui mediu minimal de geloză depus pe placă. De obicei, se prepară un amestec din 0,05 ml sau 0,1 ml de substanță de testat/soluție de testat, 0,1 ml bacterii și 0,5 ml amestec S9 sau tampon steril cu 2,0 ml geloză de acoperire. Eprubetele ar trebui să fie aerate cu ajutorul unui agitator în timpul preincubării. Pentru o bună estimare a variației, ar trebui să
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
pentru fiecare doză. Se acceptă utilizarea a doar două plăci cu depuneri, dacă se justifică științific acest lucru. Pierderea ocazională a unei plăci nu invalidează în mod necesar testul. Substanțele în stare gazoasă sau cele volatile ar trebui să fie testate în condiții corespunzătoare, de ex. în vase închise ermetic (12) (14) (15) (16). 1.5.4. Incubarea Toată plăcile dintr-un test dat ar trebui să fie incubate la 37oC timp de 48-72 de ore. După incubare, se procedează la
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
solvent și martor netratat, dacă s-a utilizat), cât și pentru plăcile cu martor pozitiv. Ar trebui să se prezinte numărătoarea pentru fiecare placă, numărul mediu de colonii care provoacă reversia pentru fiecare placă și deviația standard pentru substanța de testat și pentru martorii pozitivi și negativi (netratați și/sau solvent). Nu este necesară verificarea unui răspuns clar pozitiv. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferință prin modificarea uneia dintre condițiile experimentale. Rezultatele negative necesită
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge și la ajutorul unor metode statistice (24). Semnificația statistică nu ar trebui să fie totuși singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv. Dacă rezultatele pentru o substanță de testat nu îndeplinesc criteriile menționate anterior, substanța respectivă se consideră a fi nemutagenă în prezentul test. Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
menționate anterior, substanța respectivă se consideră a fi nemutagenă în prezentul test. Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanței de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile, independent de numărul de experimente. Rezultatele pozitive ale unui test de mutație bacteriană inversă indică faptul că substanța de testat induce mutații punctiforme prin substituirea bazelor sau decalarea cadrului de citire în genomul
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
rare datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanței de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile, independent de numărul de experimente. Rezultatele pozitive ale unui test de mutație bacteriană inversă indică faptul că substanța de testat induce mutații punctiforme prin substituirea bazelor sau decalarea cadrului de citire în genomul de Salmonella typhimurium și/sau Escherichia coli. Rezultatele negative indică faptul că, în condiții experimentale, substanța de testat nu este mutagenă pentru speciile testate. 3. RAPORTAREA RAPORTUL
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
de mutație bacteriană inversă indică faptul că substanța de testat induce mutații punctiforme prin substituirea bazelor sau decalarea cadrului de citire în genomul de Salmonella typhimurium și/sau Escherichia coli. Rezultatele negative indică faptul că, în condiții experimentale, substanța de testat nu este mutagenă pentru speciile testate. 3. RAPORTAREA RAPORTUL TESTULUI Raportul testului trebuie să conțină următoarele informații: Solventul/vehiculul: - justificarea alegerii vehiculului, - solubilitatea și stabilitatea substanței de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaște. Sușele: - sușele utilizate, - numărul de celule
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
Escherichia coli. Rezultatele negative indică faptul că, în condiții experimentale, substanța de testat nu este mutagenă pentru speciile testate. 3. RAPORTAREA RAPORTUL TESTULUI Raportul testului trebuie să conțină următoarele informații: Solventul/vehiculul: - justificarea alegerii vehiculului, - solubilitatea și stabilitatea substanței de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaște. Sușele: - sușele utilizate, - numărul de celule per cultură, - caracteristicile sușei, Condițiile de testare: - cantitatea de substanță de testat per placă (mg/placă sau μl/placă) cu justificarea alegerii dozei și numărului de plăci per
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]