13,026 matches
-
testului trebuie să conțină următoarele informații: Solventul/vehiculul: - justificarea alegerii vehiculului, - solubilitatea și stabilitatea substanței de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaște. Sușele: - sușele utilizate, - numărul de celule per cultură, - caracteristicile sușei, Condițiile de testare: - cantitatea de substanță de testat per placă (mg/placă sau μl/placă) cu justificarea alegerii dozei și numărului de plăci per concentrație, - mediile utilizate, - tipul și compoziția sistemului de activare metabolică, inclusiv criteriile de acceptabilitate, - procedurile de tratament. Rezultatele: - semnele de toxicitate, - semnele de precipitare
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
HPRT sau XPRT sunt selectate în funcție de rezistența la 6-tioguanină (TG) sau 8-azaguanină (AG). Dacă analogul unei baze sau un compus înrudit cu agentul selectiv este supus la unul din testele de mutație genică pe celule de mamifere, proprietățile substanței de testat trebuie studiate cu grijă. De exemplu, ar trebui să se examineze substanța de testat suspectată de toxicitate selectivă pentru celule mutante și nemutante. În consecință, performanța sistemului/agentului de selecție trebuie să fie confirmată atunci când se testează substanțe chimice cu
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
proprietățile substanței de testat trebuie studiate cu grijă. De exemplu, ar trebui să se examineze substanța de testat suspectată de toxicitate selectivă pentru celule mutante și nemutante. În consecință, performanța sistemului/agentului de selecție trebuie să fie confirmată atunci când se testează substanțe chimice cu o structură apropiată de cea a agentului selectiv (8). Celulele în suspensie sau în cultură monostrat se expun o perioadă de timp corespunzătoare la substanța de testat atât în prezența, cât și în absența activării metabolice și
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
sistemului/agentului de selecție trebuie să fie confirmată atunci când se testează substanțe chimice cu o structură apropiată de cea a agentului selectiv (8). Celulele în suspensie sau în cultură monostrat se expun o perioadă de timp corespunzătoare la substanța de testat atât în prezența, cât și în absența activării metabolice și se reînsămânțează pentru determinarea citotoxicității și pentru a permite manifestarea fenotipului înaintea selecției mutantului (9) (10) (11) (12) (13). Citotoxicitatea se determină, de obicei, prin măsurarea eficacității clonării relative (supraviețuirii
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
se verifice contaminarea cu micoplasmă a celulelor și, dacă se constată că sunt contaminate, nu ar trebui să se utilizeze. Testul ar trebui conceput astfel încât să aibă o sensibilitate și putere predeterminate. Numărul de celule, culturi și concentrațiile substanței de testat utilizate ar trebui să reflecte parametrii definiți anterior (14). Numărul minim de celule viabile care supraviețuiesc tratamentului și se utilizează în fiecare stadiu al testului ar trebui să fie în funcție de frecvența mutației spontane. O regulă generală constă în utilizarea unui
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
se însămânțează în mediul de cultură și se incubează la 37oC. Înainte de a fi utilizate în prezentul test, este necesară curățarea culturilor de celulele mutante preexistente. 1.4.1.4. Activarea metabolică Se recomandă ca expunerea celulelor la substanța de testat să se realizeze atât în prezența, cât și în absența unui sistem de activare metabolică corespunzător. Sistemul cel mai frecvent utilizat este o fracție postmitocondrială la care s-au adăugat cofactori (S9), preparată din ficat de rozătoare tratat cu agenți
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
și β-naftoflavonă (19) (20). Fracția post-mitocondrială se utilizează, de obicei, la concentrații cuprinse între limitele 1-10% vol./ vol. în mediul de testare final. Selectarea și tipul unui sistem de activare metabolică poate să depindă de clasa chimică a substanței de testat. În unele cazuri, ar putea fi convenabilă utilizarea mai multor concentrații ale fracției postmitocondriale. O serie de realizări, inclusiv crearea prin inginerie genetică a unor linii celulare care exprimă enzime activatoare specifice, pot să furnizeze potențialul pentru o activare endogenă
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
unor linii celulare care exprimă enzime activatoare specifice, pot să furnizeze potențialul pentru o activare endogenă. Alegerea liniilor celulare ar trebui să fie justificată din punct de vedere științific (de ex. prin importanța izoenzimei citocromului P450 pentru metabolismul substanței de testat). 1.4.1.5. Prepararea substanței de testat Substanțele de testat în stare solidă ar trebui să se preparare sub formă de soluții sau suspensii în solvenții sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului celulelor. Substanțele
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
pot să furnizeze potențialul pentru o activare endogenă. Alegerea liniilor celulare ar trebui să fie justificată din punct de vedere științific (de ex. prin importanța izoenzimei citocromului P450 pentru metabolismul substanței de testat). 1.4.1.5. Prepararea substanței de testat Substanțele de testat în stare solidă ar trebui să se preparare sub formă de soluții sau suspensii în solvenții sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului celulelor. Substanțele de testat lichide se pot adăuga direct în
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
potențialul pentru o activare endogenă. Alegerea liniilor celulare ar trebui să fie justificată din punct de vedere științific (de ex. prin importanța izoenzimei citocromului P450 pentru metabolismul substanței de testat). 1.4.1.5. Prepararea substanței de testat Substanțele de testat în stare solidă ar trebui să se preparare sub formă de soluții sau suspensii în solvenții sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului celulelor. Substanțele de testat lichide se pot adăuga direct în sistemele de testare
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
4.1.5. Prepararea substanței de testat Substanțele de testat în stare solidă ar trebui să se preparare sub formă de soluții sau suspensii în solvenții sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului celulelor. Substanțele de testat lichide se pot adăuga direct în sistemele de testare și/sau se diluează înainte de utilizare în tratamentul celulelor. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanță de testat, cu excepția cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora la păstrare
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului celulelor. Substanțele de testat lichide se pot adăuga direct în sistemele de testare și/sau se diluează înainte de utilizare în tratamentul celulelor. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanță de testat, cu excepția cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora la păstrare. 1.4.2. Condițiile de testare 1.4.2.1 Solventul/vehiculul Solventul/vehiculul ar trebui să fie ales, astfel încât să nu existe suspiciunea reacției chimice a
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
dar nu mai puțin de 10%). Pentru substanțele relativ necitotoxice, concentrația de testare maximă ar trebui să fie cea mai mică dintre următoarele trei concentrații: 5 mg/ml, 5μl/ml sau 1,01M. Substanțele relativ insolubile ar trebui să fie testate la concentrații egale sau superioare limitei de solubilitate în condițiile de cultură. Insolubilitatea ar trebui să fie pusă în evidență în mediul final de tratament în care se expun celulele. Ar putea fi utilă evaluarea solubilității la începutul și la
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
se utilizeze și martori netratați, cu excepția cazului în care există date din testele anterioare care să ateste că solventul selectat nu prezintă efecte vătămătoare sau mutagene. 1.4.3. Modul de lucru 1.4.3.1 Tratamentul cu substanța de testat Celulele în stadiu de proliferare se tratează cu substanța de testat atât în prezența, cât și în absența unui sistem de activare metabolică. Timpul de expunere ar trebui să fie corespunzător (de obicei, un timp 3-6 ore este eficient). Timpul
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
din testele anterioare care să ateste că solventul selectat nu prezintă efecte vătămătoare sau mutagene. 1.4.3. Modul de lucru 1.4.3.1 Tratamentul cu substanța de testat Celulele în stadiu de proliferare se tratează cu substanța de testat atât în prezența, cât și în absența unui sistem de activare metabolică. Timpul de expunere ar trebui să fie corespunzător (de obicei, un timp 3-6 ore este eficient). Timpul de expunere se poate prelungi cu unul sau mai multe cicluri
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
în absența unui sistem de activare metabolică. Timpul de expunere ar trebui să fie corespunzător (de obicei, un timp 3-6 ore este eficient). Timpul de expunere se poate prelungi cu unul sau mai multe cicluri celulare. Fiecare concentrație se poate testa pe una sau pe două culturi tratate. Dacă se utilizează culturi unice, numărul concentrațiilor ar trebui să fie mai mare pentru a asigura un număr suficient de culturi pentru analiză (de ex. minimum opt concentrații analizabile). Se recomandă utilizarea culturilor
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
și a eficacității clonării, celulele sunt crescute în mediu cu și, respectiv, fără agent sau agenți selectivi. Măsurarea viabilității (utilizată la calcularea frecvenței mutantului) începe la terminarea perioadei de manifestare prin depunerea celulelor într-un mediu neselectiv. Dacă substanța de testat dă un rezultat pozitiv la testul pe TK+/- L5178Y, dimensiunile coloniilor ar trebui să se determine pe minimum una dintre culturile experimentale (la concentrația pozitivă maximă) și pe martorii negativi și pozitivi. Dacă substanța de testat dă un rezultat negativ
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
neselectiv. Dacă substanța de testat dă un rezultat pozitiv la testul pe TK+/- L5178Y, dimensiunile coloniilor ar trebui să se determine pe minimum una dintre culturile experimentale (la concentrația pozitivă maximă) și pe martorii negativi și pozitivi. Dacă substanța de testat dă un rezultat negativ la testul pe TK+/- L5178Y, dimensiunile coloniilor ar trebui să se determine pe martorii negativi și pozitivi. Dimensiunile coloniilor se pot determina și în studiile în care se utilizează TK6TK+/-. 2. DATELE 2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge și la ajutorul unor metode statistice. Semnificația statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv. Dacă rezultatele obținute pentru o substanță de testat nu îndeplinesc criteriile menționate anterior, se consideră că substanța respectivă nu este mutagenă în prezentul sistem. Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare, datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
anterior, se consideră că substanța respectivă nu este mutagenă în prezentul sistem. Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare, datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanței de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile independent de numărul de repetări ale experimentului. Rezultatele pozitive ale unui test in vitro de mutație genică pe celule de mamifere indică faptul că substanța de testat produce mutații genice în celulele de
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
concluzii definitive cu privire la activitatea substanței de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile independent de numărul de repetări ale experimentului. Rezultatele pozitive ale unui test in vitro de mutație genică pe celule de mamifere indică faptul că substanța de testat produce mutații genice în celulele de mamifere, în cultură. Un rezultat concentrație-răspuns pozitiv reproductibil este foarte semnificativ. Rezultatele negative indică faptul că, în condiții experimentale, substanța de testat nu produce mutații genice în celulele de mamifere utilizate, în cultură. 3
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
de mutație genică pe celule de mamifere indică faptul că substanța de testat produce mutații genice în celulele de mamifere, în cultură. Un rezultat concentrație-răspuns pozitiv reproductibil este foarte semnificativ. Rezultatele negative indică faptul că, în condiții experimentale, substanța de testat nu produce mutații genice în celulele de mamifere utilizate, în cultură. 3. RAPORTAREA RAPORTUL TESTULUI Raportul testului trebuie să conțină următoarele informații: Solventul/vehiculul: - justificarea alegerii vehiculului, - solubilitatea și stabilitatea substanței de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaște. Celulele
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
faptul că, în condiții experimentale, substanța de testat nu produce mutații genice în celulele de mamifere utilizate, în cultură. 3. RAPORTAREA RAPORTUL TESTULUI Raportul testului trebuie să conțină următoarele informații: Solventul/vehiculul: - justificarea alegerii vehiculului, - solubilitatea și stabilitatea substanței de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaște. Celulele: - tipul și sursa celulelor, - numărul de culturi celulare, - numărul de reînsămânțări, dacă este cazul, - metodele de întreținere a culturilor celulare, dacă este cazul, - absența micoplasmei. Condițiile de testare: - justificarea alegerii concentrațiilor și numărului
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
de întreținere a culturilor celulare, dacă este cazul, - absența micoplasmei. Condițiile de testare: - justificarea alegerii concentrațiilor și numărului de culturi, inclusiv, de ex. datele de citotoxicitate și limitele de solubilitate, dacă sunt disponibile, - compoziția mediului, concentrația CO2, - concentrația substanței de testat, - volumul vehiculului și al substanței de testat adăugate, - temperatura de incubare, - timpul de incubare, - durata tratamentului, - densitatea celulară în timpul tratamentului, - tipul și compoziția sistemului de activare metabolică, inclusiv criteriile de acceptabilitate, - martorii pozitivi și negativi, - timpul de manifestare (inclusiv numărul
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
cazul, - absența micoplasmei. Condițiile de testare: - justificarea alegerii concentrațiilor și numărului de culturi, inclusiv, de ex. datele de citotoxicitate și limitele de solubilitate, dacă sunt disponibile, - compoziția mediului, concentrația CO2, - concentrația substanței de testat, - volumul vehiculului și al substanței de testat adăugate, - temperatura de incubare, - timpul de incubare, - durata tratamentului, - densitatea celulară în timpul tratamentului, - tipul și compoziția sistemului de activare metabolică, inclusiv criteriile de acceptabilitate, - martorii pozitivi și negativi, - timpul de manifestare (inclusiv numărul de celule însămânțate și reînsămânțate, programele de
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]