20,996 matches
-
anchetelor asupra cartofilor, - suprafața totală estimată cultivată, în hectare, a cartofilor de sămânță și a altor tipuri de cartofi, - stratificarea pe categorii de semințe și de producție marfă și, dacă este cazul, pe regiune, - numărul și perioada de prelevare a eșantioanelor luate pentru testare, - numărul inspecțiilor vizuale de pe teren, - numărul (și dimensiunea eșantionului) de inspecții vizuale asupra tuberculilor; (ii) în cazul anchetelor asupra cel puțin a culturii în creștere de plante de tomate destinate replantării în scop profesional, - numărul total estimat
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
sămânță și a altor tipuri de cartofi, - stratificarea pe categorii de semințe și de producție marfă și, dacă este cazul, pe regiune, - numărul și perioada de prelevare a eșantioanelor luate pentru testare, - numărul inspecțiilor vizuale de pe teren, - numărul (și dimensiunea eșantionului) de inspecții vizuale asupra tuberculilor; (ii) în cazul anchetelor asupra cel puțin a culturii în creștere de plante de tomate destinate replantării în scop profesional, - numărul total estimat de plante, - numărul inspecțiilor vizuale; (iii) în cazul anchetelor asupra plantelor gazdă
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
în creștere de plante de tomate destinate replantării în scop profesional, - numărul total estimat de plante, - numărul inspecțiilor vizuale; (iii) în cazul anchetelor asupra plantelor gazdă, altele decât cartofi și tomate, inclusiv plante gazdă solanacee sălbatice, - specie, - numărul și perioada eșantioanelor prelevate, - zona/râul eșantionat, dacă este cazul, - metoda de analiză; (iv) în cazul anchetelor asupra apei și deșeurilor lichide deversate din instalațiile de prelucrare industrială sau de ambalare, - numărul și perioada luării probelor, - zona/râul/situarea instalațiilor eșantionate, dacă este
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
YABUUCHI ET AL. DOMENIUL DE APLICARE AL PROTOCOLULUI DE TESTARE Protocolul prezentat descrie diversele proceduri implicate în: (i) diagnosticarea putregaiului brun din tuberculii de cartof și a ofilirii bacteriene la plantele de cartof și tomate; (ii) detectarea Ralstonia solanacearum în eșantioanele de tuberculi de cartof; (iii) identificarea Ralstonia solanacearum. În apendice se oferă detalii cu privire la prepararea materialelor de testare, adică mediul de cultură, tampoanele, soluțiile, reactivii. CUPRINS: SECȚIUNEA I: Aplicarea protocolului de testare..............................................................9 1. Diagnosticarea putregaiului brun din tuberculii de
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
mediul de cultură, tampoanele, soluțiile, reactivii. CUPRINS: SECȚIUNEA I: Aplicarea protocolului de testare..............................................................9 1. Diagnosticarea putregaiului brun din tuberculii de cartof și a ofilirii bacteriene la plantele de cartof și tomată .......................9 2. Detectarea și identificarea Ralstonia solanacearum în eșantioanele de tuberculi de cartof ...............................................................11 SECȚIUNEA II: Diagnosticarea putregaiului brun din tuberculii de cartof și a ofilirii bacteriene la plantele de cartof și tomată.................................13 1. Simptome..................................................................................13 2. Test(e) de triere rapidă..............................................................13 3. Procedură de izolare..................................................................14
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
și a ofilirii bacteriene la plantele de cartof și tomată.................................13 1. Simptome..................................................................................13 2. Test(e) de triere rapidă..............................................................13 3. Procedură de izolare..................................................................14 4. Test(e) de confirmare................................................................14 SECȚIUNEA III: Detectarea și identificarea Ralstonia solanacearum în eșantioanele de tuberculi de cartof.........................................................................17 1. Pregătirea eșantionului pentru testare...................................................17 2. Test de imunofluorescență (IF)............................................................18 3. Test de imunoadsorbție cu anticorpi marcați enzimatic (ELISA)........20 4. Testul de reacție de polimerizare în lanț (PCR(tm))..........................20 5. Testul
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
și tomată.................................13 1. Simptome..................................................................................13 2. Test(e) de triere rapidă..............................................................13 3. Procedură de izolare..................................................................14 4. Test(e) de confirmare................................................................14 SECȚIUNEA III: Detectarea și identificarea Ralstonia solanacearum în eșantioanele de tuberculi de cartof.........................................................................17 1. Pregătirea eșantionului pentru testare...................................................17 2. Test de imunofluorescență (IF)............................................................18 3. Test de imunoadsorbție cu anticorpi marcați enzimatic (ELISA)........20 4. Testul de reacție de polimerizare în lanț (PCR(tm))..........................20 5. Testul de placare selectivă ..............................................................22 6. Testul de probă
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
tm))..........................20 5. Testul de placare selectivă ..............................................................22 6. Testul de probă biologică.....................................................................23 7. Teste de îmbogățire..............................................................................23 8. Testul de patogenicitate.......................................................................23 Apendice 1 Medii nutritive pentru izolarea și cultura Ralstonia solanacearum.....................24 Apendicele 2 Materiale pentru pregătirea eșantionului...........................................................25 Apendicele 3 Materiale pentru testul IF.................................................................................26 Apendicele 4 Determinarea nivelului de contaminare în testul IF..........................................27 Apendicele 5 Materiale pentru testul ELISA..........................................................................28 Apendicele 6 Materiale pentru testul PCR..............................................................................29 Apendicele 7 Materiale pentru test(ele) de placare
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
obținută prin cel puțin unul dintre testele enumerate în secțiunea II.4.1, în combinație cu un test de patogenicitate (secțiunea II.4.3). Caracterizarea sușei este opțională, dar recomandată pentru fiecare caz nou. Detectarea și identificarea Ralstonia solanacearum din eșantioanele de tuberculi de cartof Protocolul este destinat detectării infecțiilor latente în tuberculii de cartof printr-unul sau, de preferință, mai multe teste de triere care, dacă sunt pozitive, sunt suplimentate prin izolarea agentului patogen; urmat de identificarea unei culturi pure
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
unul sau, de preferință, mai multe teste de triere care, dacă sunt pozitive, sunt suplimentate prin izolarea agentului patogen; urmat de identificarea unei culturi pure ca fiind Ralstonia solanacearum , în cazul izolării unor colonii tipice. Referințe la diagramă 1 Mărimea eșantionului Mărimea standard este de 200 tuberculi. Cu toate acestea, protocolul poate fi aplicat în mod convenabil eșantioanelor cu mai puțin de 200 de tuberculi. 2 Test(e) de triere Un singur test poate să fie insuficient de sensibil sau de
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
agentului patogen; urmat de identificarea unei culturi pure ca fiind Ralstonia solanacearum , în cazul izolării unor colonii tipice. Referințe la diagramă 1 Mărimea eșantionului Mărimea standard este de 200 tuberculi. Cu toate acestea, protocolul poate fi aplicat în mod convenabil eșantioanelor cu mai puțin de 200 de tuberculi. 2 Test(e) de triere Un singur test poate să fie insuficient de sensibil sau de sigur pentru detectarea Ralstonia solanacearum dintr-un eșantion. Din acest motiv se recomandă mai mult de un
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
toate acestea, protocolul poate fi aplicat în mod convenabil eșantioanelor cu mai puțin de 200 de tuberculi. 2 Test(e) de triere Un singur test poate să fie insuficient de sensibil sau de sigur pentru detectarea Ralstonia solanacearum dintr-un eșantion. Din acest motiv se recomandă mai mult de un test, iar aceste teste ar fi de preferat să se bazeze pe principii biologice diferite. 3 Test de imunofluorescență (IF) Testul IF este un test de triere bine cunoscut. Acesta reprezintă
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
mai recomandat test este placarea selectivă. 4 Placarea selectivă Împreună cu mediul SMSA modificat și metodologia de testare specificată în această metodă, acesta este un test sensibil și selectiv pentru Ralstonia solanacearum. Rezultatul este disponibil la 3 -6 zile după prepararea eșantionului. Agentul patogen este obținut direct în cultură și poate fi identificat imediat. Pentru exploatarea completă a potențialului său, testul cere o pregătire atentă a taloanelor pentru a se evita bacteriile secundare asociate tuberculului de cartof care sunt organisme concurente ale
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
se pot dezvolta în mediu. Placarea selectivă poate fi utilizată ca test unic de triere cu condiția ca în cazurile în care se bănuiește Inhibiția Ralstonia solanacearum de alte bacterii de pe plăci și se obține un rezultat negativ al testului, eșantionul este testat din nou utilizând un test diferit pentru confirmarea sau infirmarea diagnosticului. În asemenea cazuri cel mai recomandat test este testul IF. 5 Testul ELISA Testul ELISA este în general mai puțin sensibil decât testul IF (prag de sensibilitate
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
fals. Unii cultivari de cartof conțin mai mulți inhibitori decât alții. De aceea este necesară îndepărtarea acestor inhibitori. Inhibiția se poate reduce prin diluare, dar se diluează și populația de Ralstonia solanacearum. Trebuie acordată multă atenție în toate etapele pregătirii eșantionului și testului pentru a împiedica contaminarea care ar duce la teste pozitive false. Testele pozitive false pot să apară de asemenea din omologie de secvențe cu alte organisme. Din aceste motive, testul direct PCR nu poate fi folosit ca test
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
ar duce la teste pozitive false. Testele pozitive false pot să apară de asemenea din omologie de secvențe cu alte organisme. Din aceste motive, testul direct PCR nu poate fi folosit ca test unic de triere. 7 Testul de îmbogățire Eșantioanele de extract final de cartof incubat în mediu nutritiv semi-selectiv, cum este mediul nutrivitv modificat SMSA, permite multiplicarea Ralstonia solanacearum. Poate mult mai important este faptul că, de asemenea, diluează potențialii inhibitori ai testelor ELISA sau PCR. Astfel, Ralstonia solanacearum
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
suspendă într-un volum mic de apă distilată sterilă sau cu un tampon fosfat de 50 mM. Se pune pe placă, se incubează și se verifică existența coloniilor tipice de Ralstonia solanacearum. SECȚIUNEA III DETECTAREA ȘI IDENTIFICAREA RALSTONIA SOLANACEARUM ÎN EȘANTIOANELE DE TUBERCULI DE CARTOF Notă: Mărimea standard a eșantionului este de 200 de tuberculi. Cu toate acestea procedura se poate aplica în mod convenabil eșantioanelor cu mai puțin de 200 de tuberculi. 1. Pregătirea eșantionului pentru testare Notă: Extractul final
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
sau cu un tampon fosfat de 50 mM. Se pune pe placă, se incubează și se verifică existența coloniilor tipice de Ralstonia solanacearum. SECȚIUNEA III DETECTAREA ȘI IDENTIFICAREA RALSTONIA SOLANACEARUM ÎN EȘANTIOANELE DE TUBERCULI DE CARTOF Notă: Mărimea standard a eșantionului este de 200 de tuberculi. Cu toate acestea procedura se poate aplica în mod convenabil eșantioanelor cu mai puțin de 200 de tuberculi. 1. Pregătirea eșantionului pentru testare Notă: Extractul final de cartof obținut în această procedură poate fi utilizate
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
verifică existența coloniilor tipice de Ralstonia solanacearum. SECȚIUNEA III DETECTAREA ȘI IDENTIFICAREA RALSTONIA SOLANACEARUM ÎN EȘANTIOANELE DE TUBERCULI DE CARTOF Notă: Mărimea standard a eșantionului este de 200 de tuberculi. Cu toate acestea procedura se poate aplica în mod convenabil eșantioanelor cu mai puțin de 200 de tuberculi. 1. Pregătirea eșantionului pentru testare Notă: Extractul final de cartof obținut în această procedură poate fi utilizate de asemenea pentru detectarea Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Opțiuni de pre-testare dacă sunt considerate utile: (i
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
ȘI IDENTIFICAREA RALSTONIA SOLANACEARUM ÎN EȘANTIOANELE DE TUBERCULI DE CARTOF Notă: Mărimea standard a eșantionului este de 200 de tuberculi. Cu toate acestea procedura se poate aplica în mod convenabil eșantioanelor cu mai puțin de 200 de tuberculi. 1. Pregătirea eșantionului pentru testare Notă: Extractul final de cartof obținut în această procedură poate fi utilizate de asemenea pentru detectarea Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Opțiuni de pre-testare dacă sunt considerate utile: (i) se incubează eșantionul la 25 - 30°C până la două săptămâni
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
puțin de 200 de tuberculi. 1. Pregătirea eșantionului pentru testare Notă: Extractul final de cartof obținut în această procedură poate fi utilizate de asemenea pentru detectarea Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Opțiuni de pre-testare dacă sunt considerate utile: (i) se incubează eșantionul la 25 - 30°C până la două săptămâni pentru a încuraja multiplicarea populațiilor mici de Ralstonia solanacearum (ii) se spală tuberculii sub jet de apă cu dezinfectanți și detergenți corespunzători. Tuberculii se usucă la aer. 1.1. Cu un scalpel sau
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
de la talonul tuberculului, astfel încât să fie vizibile țesuturile vasculare. Se taie cu atenție un miez conic mic (3 - 5 mm diametru) de țesut vascular de la talon. Cantitatea de țesut nevascular trebuie redusă la minim. Se prelucrează fiecare dintre tuberculii din eșantion. Notă: În această etapă se poate efectua examinarea vizuală a tuberculilor (secțiunea II.1). Se separă orice tubercul cu simptome sau putrefacție severă și se testează separat (secțiunea II) 1.2. Se colectează taloanele într-un container închis. Este preferabil
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
volum standard (15 μl este adecvat unei ferestre de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru ferestre mai mari) din extractul concentrat resuspendat într-un șir de ferestre. Șirul rămas poate fi folosit ca duplicat sau pentru un al doilea eșantion, după cum se prezintă în figura 1. (ii) pentru alte extracte concentrate: Se pregătesc diluții zecimale de 1/10, 1/100 și 1/1 000 din extractul concentrat resuspendat în tamponul de concentrare. Se pipetează un volum standard (15 μl corespund
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
15 μl corespund unei ferestre de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru ferestre mai mari) din extractul concentrat resuspendat și fiecare diluție într-un șir de ferestre. Șirul rămas poate fi folosit ca duplicat sau pentru un al doilea eșantion, după cum se prezintă în figura 2. 2.2. Se lasă picăturile să se usuce. Celulele bacteriene se fixează pe lamă prin încălzire, trecere prin flacără sau cu 95% etanol. 2.3 Procedura IF (i) În conformitate cu pregătirea lamei de test de la
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
de obicei jumătate din titru. Figura 1 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (i) și 2.3 pct. (i) Diluție standard a extractului concentrat resuspendat T = titru FITC T/4 T/2 T 2T => diluțiile duble ale antiserului Eșantionul 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 Figura 2 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (ii) și 2.3 pct. (ii) FITC Diluție standard a antiserului pur
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]