22,461 matches
-
apei și se asigură prelevarea, de asemenea, din afluenții cursului de apă. 2.1.2. Se transportă eșantioanele în condiții de întuneric și la temperatură joasă (4-10 °C) și se testează pe parcursul a 24 ore. 2.1.3. La nevoie, fragmentul bacterian poate fi concentrat prin una dintre următoarele metode: (a) Se centrifughează 30-50 ml de subeșantioane la 10 000 g timp de zece minute (sau la 7 000 g timp de 15 minute), preferabil la o temperatură de 4-10 °C
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
PCR în locul eșantionului. 6.2.5. Tuburile se introduc în același ciclor termic ca și cel utilizat la testul preliminar și se lansează programul PCR optimizat în mod corespunzător (apendicele 6). 6.3. Analiza produsului reacției PCR 6.3.1. Fragmentele PCR se detectează prin electroforeză în gel de agar. Se pune sub tensiune la 5-8 V/cm o cantitate de cel puțin 12 μl de amestec reactiv de ADN amplificat din fiecare eșantion împreună cu 3 μl de tampon de lest
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
eșantion împreună cu 3 μl de tampon de lest (apendicele 6) pe un mediu agarizat la 2,0 % într-un tampon tri-acetat-EDTA (ETA) (apendicele 6). Se folosește un marcator de ADN corespunzător, precum "100 bp ladder". 6.3.2. Pentru vizualizarea fragmentelor de ADN, se recurge la colorare cu bromură de etidiu (la 0,5 mg/l) timp de 30-60 de minute, luând măsurile de precauție necesare pentru manipularea acestui agent mutagen. 6.3.3. În cazul unor produse PCR amplificate având
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
3. În cazul unor produse PCR amplificate având mărimea așteptată (apendicele 6), gelul colorat se vizualizează prin iluminare ultravioletă cu unde scurte (λ = 302 nm) și se notează rezultatele. 6.3.4. Pentru noile cazuri sau constatări, se verifică autenticitatea fragmentului amplificat PCR efectuând o analiză enzimatică restrictivă pe un eșantion al ADN amplificat rămas. În acest scop, se incubează la o temperatură optimă pe o durată optimă folosind o enzimă și un tampon corespunzător (a se vedea apendicele 6). Fragmentele
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
fragmentului amplificat PCR efectuând o analiză enzimatică restrictivă pe un eșantion al ADN amplificat rămas. În acest scop, se incubează la o temperatură optimă pe o durată optimă folosind o enzimă și un tampon corespunzător (a se vedea apendicele 6). Fragmentele digerate prin electroforeză în gel de agar se detectează în conformitate cu metoda descrisă anterior și se vizualizează prin iluminare ultravioletă dispunerea tipică a fragmentelor după analiza enzimatică restrictivă și colorarea cu bromură de etidiu. Apoi se compară cu sușele de control
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
optimă pe o durată optimă folosind o enzimă și un tampon corespunzător (a se vedea apendicele 6). Fragmentele digerate prin electroforeză în gel de agar se detectează în conformitate cu metoda descrisă anterior și se vizualizează prin iluminare ultravioletă dispunerea tipică a fragmentelor după analiza enzimatică restrictivă și colorarea cu bromură de etidiu. Apoi se compară cu sușele de control pozitiv înainte și după macerare. Interpretarea rezultatului testului PCR Testul PCR este negativ atunci când în eșantionul respectiv nu este detectat fragmentul PCR caracteristic
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
tipică a fragmentelor după analiza enzimatică restrictivă și colorarea cu bromură de etidiu. Apoi se compară cu sușele de control pozitiv înainte și după macerare. Interpretarea rezultatului testului PCR Testul PCR este negativ atunci când în eșantionul respectiv nu este detectat fragmentul PCR caracteristic de R. solanacearum având dimensiunea prevăzută, iar fragmentul este detectat pentru toate eșantioanele de control pozitiv (în cazul unui test PCR compus, cu primeri de control intern specifici plantei: un al doilea produs PCR de dimensiunea prevăzută trebuie
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
bromură de etidiu. Apoi se compară cu sușele de control pozitiv înainte și după macerare. Interpretarea rezultatului testului PCR Testul PCR este negativ atunci când în eșantionul respectiv nu este detectat fragmentul PCR caracteristic de R. solanacearum având dimensiunea prevăzută, iar fragmentul este detectat pentru toate eșantioanele de control pozitiv (în cazul unui test PCR compus, cu primeri de control intern specifici plantei: un al doilea produs PCR de dimensiunea prevăzută trebuie amplificat cu eșantionul respectiv). Testul PCR este pozitiv în cazul
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
eșantioanele de control pozitiv (în cazul unui test PCR compus, cu primeri de control intern specifici plantei: un al doilea produs PCR de dimensiunea prevăzută trebuie amplificat cu eșantionul respectiv). Testul PCR este pozitiv în cazul în care este detectat fragmentul PCR caracteristic de R. solanacearum de dimensiunea și tipul de restricție prevăzut (atunci când este nevoie), cu condiția să nu fie amplificat cu unul dintre eșantioanele de control negativ. Se poate obține o confirmare fiabilă a rezultatului pozitiv prin repetarea testului
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
unul dintre eșantioanele de control negativ. Se poate obține o confirmare fiabilă a rezultatului pozitiv prin repetarea testului cu un al doilea set de primeri PCR (apendicele 6). Notă: Se poate suspecta o inhibiție a PCR în cazul în care fragmentul amplificat prevăzut este obținut din eșantionul de control pozitiv conținând R. solanacearum în apă, dar se obțin rezultate negative din eșantioane de control pozitiv conținând R. solanacearum în extractul de cartof. În protocoalele PCR compuse, cu control intern al PCR
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
în apă, dar se obțin rezultate negative din eșantioane de control pozitiv conținând R. solanacearum în extractul de cartof. În protocoalele PCR compuse, cu control intern al PCR, se constată inhibiția reacției atunci când nu se obține nici unul dintre cele două fragmente amplificate. Se poate suspecta o contaminare atunci când fragmentul amplificat prevăzut este obținut din unul sau mai multe controale negative. 7. Testul FISH Principiu În cazul în care testul FISH se folosește în calitate de test principal de selecție și rezultatul lui este
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
eșantioane de control pozitiv conținând R. solanacearum în extractul de cartof. În protocoalele PCR compuse, cu control intern al PCR, se constată inhibiția reacției atunci când nu se obține nici unul dintre cele două fragmente amplificate. Se poate suspecta o contaminare atunci când fragmentul amplificat prevăzut este obținut din unul sau mai multe controale negative. 7. Testul FISH Principiu În cazul în care testul FISH se folosește în calitate de test principal de selecție și rezultatul lui este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare sau
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
baie de abur fierbinte la 100 °C timp de patru minute. Eșantioanele pot fi păstrate apoi la o temperatură situată între - 16 și - 24 °C până în momentul în care sunt necesare. 4.3. Se aplică procedurile PCR corespunzătoare pentru amplificarea fragmentelor tipice de R. solanacearum [a se vedea, de exemplu, Seal et al. (1993), Pastrik & Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al. (1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)]. 4.4. O identificare pozitivă a R.
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
a se vedea, de exemplu, Seal et al. (1993), Pastrik & Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al. (1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)]. 4.4. O identificare pozitivă a R. solanacearum se obține atunci când fragmentele amplificate PCR au aceeași dimensiune și aceleași polimorfisme ale dimensiunii fragmentelor de restricție ca în cazul celor ale sușei de control pozitiv. 5. Testul FISH 5.1. Se prepară o suspensie de circa 106 celule/ml în apă ultrapură. 5
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al. (1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)]. 4.4. O identificare pozitivă a R. solanacearum se obține atunci când fragmentele amplificate PCR au aceeași dimensiune și aceleași polimorfisme ale dimensiunii fragmentelor de restricție ca în cazul celor ale sușei de control pozitiv. 5. Testul FISH 5.1. Se prepară o suspensie de circa 106 celule/ml în apă ultrapură. 5.2. Se aplică procedura FISH (secțiunea VI.A.7) cu cel
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
mezo-inozitei + - + Utilizarea D-ribozei - - + Activitate pectolitică 1 scăzută scăzută ridicată 1 A se vedea Lelliott & Stead (1987) 7.2. Amprentă genomică Diferențierea moleculară a sușelor din complexul R. solanacearum se poate face prin: 7.2.1. Analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor de restricție RFLP (Cook et al., 1989). 7.2.2. PCR pe secvențe repetitive folosind primeri [REP, BOX și ERIC (Louws et al, 1995; Smith et al, 1995)]. 7.2.3. Analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor de restricție amplificate (Van der
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
2.1. Analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor de restricție RFLP (Cook et al., 1989). 7.2.2. PCR pe secvențe repetitive folosind primeri [REP, BOX și ERIC (Louws et al, 1995; Smith et al, 1995)]. 7.2.3. Analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor de restricție amplificate (Van der Wolf et al., 1998). 7.3. Metodele PCR Se pot folosi primeri specifici PCR (Pastrik et al., 2002; a se vedea apendicele 6) pentru a diferenția sușele aparținând diviziunii 1 (biovari 3, 4 și 5
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
C. Notă: Acest program a fost optimizat pentru o utilizare cu ciclorul termic PerkinElmer 9600. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (ii), (iii) și (iv) pentru o utilizare cu alte modele. 1.4. Analiza restricției enzimatice a amplimerului Fragmentele PCR amplificate de ADN de R. solanacearum produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricție după incubare la 37 °C cu enzima Ava II. 2. Protocolul PCR Pastrik & Maiss (2000) 2.1. Secvența de primer de oligonucleotide Primer
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
9600. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (ii), (iii) și (iv) pentru o utilizare cu alte modele. 1.4. Analiza restricției enzimatice a amplimerului Fragmentele PCR amplificate de ADN de R. solanacearum produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricție după incubare la 37 °C cu enzima Ava II. 2. Protocolul PCR Pastrik & Maiss (2000) 2.1. Secvența de primer de oligonucleotide Primer sens Ps-1 5΄-agt cga acg gca gcg ggg g-3΄ Primer antisens Ps-2 5
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (ii), (iii) și (iv) pentru o utilizare cu alte modele. 2.4. Analiza restricției enzimatice a amplimerului Produsele PCR amplificate de ADN de R. solanacearum produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricție după incubare la 65 °C cu enzima Taq I timp de 30 de minute. Fragmentele de restricție obținute din fragmentul specific de R. solanacearum au o lungime de 457 bp și de 96 bp. 3. Protocolul PCR compus
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
alte modele. 2.4. Analiza restricției enzimatice a amplimerului Produsele PCR amplificate de ADN de R. solanacearum produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricție după incubare la 65 °C cu enzima Taq I timp de 30 de minute. Fragmentele de restricție obținute din fragmentul specific de R. solanacearum au o lungime de 457 bp și de 96 bp. 3. Protocolul PCR compus, cu control intern al PCR (Pastrik et al., 2002) 3.1. Secvența de primer de oligonucleotide Primer
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
restricției enzimatice a amplimerului Produsele PCR amplificate de ADN de R. solanacearum produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricție după incubare la 65 °C cu enzima Taq I timp de 30 de minute. Fragmentele de restricție obținute din fragmentul specific de R. solanacearum au o lungime de 457 bp și de 96 bp. 3. Protocolul PCR compus, cu control intern al PCR (Pastrik et al., 2002) 3.1. Secvența de primer de oligonucleotide Primer sens Rs-1-F 5΄-ACT AAC
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
PTC 200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (ii), (iii) și (iv) pentru utilizarea cu alte modele. 3.4. Analiza restricției enzimatice a amplimerului Produsele PCR amplificate de ADN de R. solanacearum produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricție după incubare la 65 °C cu enzima Bsm I sau un izoschizomer (de exemplu, Mva 1269 I) timp de 30 de minute. 4. Protocolul PCR specific biovarului de R. solanacearum (Pastrik et al., 2001) 4.1. Secvența de
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
o modificare a duratei ciclurilor (ii), (iii) și (iv) pentru utilizarea cu alte modele. 4.4. Analiza restricției enzimatice a amplimerului Produsele PCR amplificate de ADN de R. solanacearum utilizând primerii Rs-1-F și Rs-1-R produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricție după incubare la 65 °C cu enzima Bsm I sau un izoschizomer (de exemplu, Mva 1269 I) timp de 30 de minute. Produsele PCR amplificate de ADN de R. solanacearum utilizând primerii Rs-1-F și Rs-3-R nu au puncte
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
necesar, să indice componentele supuse uzurii și criteriile după care acestea trebuie înlocuite. În cazul în care riscul de distrugere sau dezintegrare rămâne prezent în ciuda luării acestor măsuri, componentele respective trebuie montate, poziționate și/sau prevăzute cu apărători astfel încât toate fragmentele să poată fi reținute, prevenind situații periculoase. Atât țevile rigide, cât și cele flexibile care conțin lichide, în special sub presiune, trebuie să poată rezista la stresul intern și extern și trebuie să fie ferm fixate și/sau protejate pentru
32006L0042-ro () [Corola-website/Law/295051_a_296380]