3,310 matches
-
cu un număr cunoscut de copii puse împreună cu proba de testat, amplificat prin PCR, hibridizat și apoi detectat. Realizarea testului ADN-VHB are loc în patru etape: prepararea probei (extracția ADN), amplificarea PCR folosind primeri specifici, hibridizare și detecția produșilor de amplificare prin determinare colorimetrică. Particulele virale VHB sunt lizate prin incubare la o temperatură ridicată, cu ajutorul unei proteaze care lizează celula și eliberează acizi nucleici, protejând ADN-VHB eliberat din deoxiribonucleaza din plasmă și ser. Un număr cunoscut de molecule cuantificabile ADN-VHB
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
cum ar fi săruri, proteine și alte impurități celulare sunt eliminate prin centrifugare. Acizii nucleici absorbiți se spală și se eluează cu o soluție apoasă. Proba prelucrată care conține ADN VHB și ADN VHB standard, se adaugă la etapa de amplificare/detectare. ADN-ul VHB țintă și ADN-ul VHB standard sunt apoi amplificate și detectate pe aparatele de analiză folosind reactivii de amplificare și de detecție furnizate în kitul de testare. Selectarea secvenței ADN VHB țintă depinde de identificarea regiunilor
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
soluție apoasă. Proba prelucrată care conține ADN VHB și ADN VHB standard, se adaugă la etapa de amplificare/detectare. ADN-ul VHB țintă și ADN-ul VHB standard sunt apoi amplificate și detectate pe aparatele de analiză folosind reactivii de amplificare și de detecție furnizate în kitul de testare. Selectarea secvenței ADN VHB țintă depinde de identificarea regiunilor cadru din genomul VHB care prezintă aceeași secvență între toate genotipurile. În consecință, selectarea adecvată a primerilor și probelor este critică pentru capacitatea
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
consecință, selectarea adecvată a primerilor și probelor este critică pentru capacitatea de detectare a tuturor genotipurilor VHB relevante clinic. O regiune parțial monocatenară a genomului circular VHB prezintă capacitatea de conservare maximă a secvențelor de ADN între genotipuri. Testul de amplificare VHB utilizează primeri care definesc o secvență în regiunea superioară pre-Core/Core a genomului VHB. b) Amplificarea probei Probele prelucrate sunt adăugate la amestecul de amplificare în tuburi de amplificare (K-tuburi), în care se produce amplificarea PCR. Analizorul încălzește amestecul
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
relevante clinic. O regiune parțial monocatenară a genomului circular VHB prezintă capacitatea de conservare maximă a secvențelor de ADN între genotipuri. Testul de amplificare VHB utilizează primeri care definesc o secvență în regiunea superioară pre-Core/Core a genomului VHB. b) Amplificarea probei Probele prelucrate sunt adăugate la amestecul de amplificare în tuburi de amplificare (K-tuburi), în care se produce amplificarea PCR. Analizorul încălzește amestecul de reacție pentru a denatura ADN-ul dublu catenar și expune secvențele țintă specifice ale genomului VHB
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
VHB prezintă capacitatea de conservare maximă a secvențelor de ADN între genotipuri. Testul de amplificare VHB utilizează primeri care definesc o secvență în regiunea superioară pre-Core/Core a genomului VHB. b) Amplificarea probei Probele prelucrate sunt adăugate la amestecul de amplificare în tuburi de amplificare (K-tuburi), în care se produce amplificarea PCR. Analizorul încălzește amestecul de reacție pentru a denatura ADN-ul dublu catenar și expune secvențele țintă specifice ale genomului VHB circular și ale ADN-ului VHB standard. Când amestecul
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
conservare maximă a secvențelor de ADN între genotipuri. Testul de amplificare VHB utilizează primeri care definesc o secvență în regiunea superioară pre-Core/Core a genomului VHB. b) Amplificarea probei Probele prelucrate sunt adăugate la amestecul de amplificare în tuburi de amplificare (K-tuburi), în care se produce amplificarea PCR. Analizorul încălzește amestecul de reacție pentru a denatura ADN-ul dublu catenar și expune secvențele țintă specifice ale genomului VHB circular și ale ADN-ului VHB standard. Când amestecul se răcește, primerii reconstituie
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
între genotipuri. Testul de amplificare VHB utilizează primeri care definesc o secvență în regiunea superioară pre-Core/Core a genomului VHB. b) Amplificarea probei Probele prelucrate sunt adăugate la amestecul de amplificare în tuburi de amplificare (K-tuburi), în care se produce amplificarea PCR. Analizorul încălzește amestecul de reacție pentru a denatura ADN-ul dublu catenar și expune secvențele țintă specifice ale genomului VHB circular și ale ADN-ului VHB standard. Când amestecul se răcește, primerii reconstituie ADN-ul țintă. Polimeraza termostabilă Thermus
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
șablonul țintă și produce o moleculă de ADN dublu catenar denumită amplicon. Analizorul repetă automat acest proces pentru un număr desemnat de cicluri. Fiecare ciclu este destinat să dubleze cantitatea de ampliconi. Numărul necesar de cicluri este preprogramat în analizor. Amplificarea are loc numai în regiunea genomului VHB dintre primeri. Nu este amplificat întregul genom VHB. Amplificarea selectivă a acidului nucleic țintă din probă se realizează prin utilizarea enzimei AmpErase (uracil-N-glicozilază) și trifosfat dezoxiuridină (dUTP). Enzima AmpErase recunoaște și catalizează distrugerea
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
proces pentru un număr desemnat de cicluri. Fiecare ciclu este destinat să dubleze cantitatea de ampliconi. Numărul necesar de cicluri este preprogramat în analizor. Amplificarea are loc numai în regiunea genomului VHB dintre primeri. Nu este amplificat întregul genom VHB. Amplificarea selectivă a acidului nucleic țintă din probă se realizează prin utilizarea enzimei AmpErase (uracil-N-glicozilază) și trifosfat dezoxiuridină (dUTP). Enzima AmpErase recunoaște și catalizează distrugerea catenelor ADN care conțin deoxiuridine 26 și nu conțin dezoxitimidină. Dezoxiuridina nu este prezentă în ADN
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
în ADN-ul natural, dar este întotdeauna prezentă în amplicon, datorită utilizării trifosfat-dezoxiuridinei ca unul dintre DNTP-uri din Master Mix-ul reactiv, de aceea, numai ampliconul conține dezoxiuridina. Dezoxiuridina redă ampliconi contaminanți susceptibili la distrugere de către enzima AmpErase, anterior amplificării ADN-ului țintă. De asemenea, orice produs nespecific format după activarea inițială a Master Mix-ului de mangan este distrus de către enzima AmpErase, îmbunătățind astfel sensibilitatea și specificitatea. Enzima AmpErase, care este inclusă în Master Mix, catalizează clivajul dezoxiuridinei prin
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
dezoxiriboză în poziția C1. Când este încălzit, în prima etapă a ciclurilor, ampliconul se sparge la poziția dezoxiuridina angajând astfel ADN-uri non-amplificabile. Enzima AmpErase este inactivă la temperaturi de peste 55° C, prin urmare, nu distruge ampliconii țintă formați în timpul amplificării. c) Detectarea produșilor de amplificare PCR Pentru detectarea VHB se utilizează tehnologia real time PCR. În analizor, ADN-ul VHB și ADN-ul VHB standard sunt etichetate cu diferiți markeri fluorescenți. Monitorizarea intensității fluorescenței markerilor eliberați în timpul procesului de amplificare
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
este încălzit, în prima etapă a ciclurilor, ampliconul se sparge la poziția dezoxiuridina angajând astfel ADN-uri non-amplificabile. Enzima AmpErase este inactivă la temperaturi de peste 55° C, prin urmare, nu distruge ampliconii țintă formați în timpul amplificării. c) Detectarea produșilor de amplificare PCR Pentru detectarea VHB se utilizează tehnologia real time PCR. În analizor, ADN-ul VHB și ADN-ul VHB standard sunt etichetate cu diferiți markeri fluorescenți. Monitorizarea intensității fluorescenței markerilor eliberați în timpul procesului de amplificare pentru detectarea în timp real
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
amplificării. c) Detectarea produșilor de amplificare PCR Pentru detectarea VHB se utilizează tehnologia real time PCR. În analizor, ADN-ul VHB și ADN-ul VHB standard sunt etichetate cu diferiți markeri fluorescenți. Monitorizarea intensității fluorescenței markerilor eliberați în timpul procesului de amplificare pentru detectarea în timp real a produșilor de amplificare PCR, se face prin utilizarea probelor dual- etichetate fluorescente. Probele de ADN-VHB și ADN-VHB standard conțin oligonucleotide standard specifice etichetate cu un marker fluorescent și un colorant. Când dubla fluorescență a
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
VHB se utilizează tehnologia real time PCR. În analizor, ADN-ul VHB și ADN-ul VHB standard sunt etichetate cu diferiți markeri fluorescenți. Monitorizarea intensității fluorescenței markerilor eliberați în timpul procesului de amplificare pentru detectarea în timp real a produșilor de amplificare PCR, se face prin utilizarea probelor dual- etichetate fluorescente. Probele de ADN-VHB și ADN-VHB standard conțin oligonucleotide standard specifice etichetate cu un marker fluorescent și un colorant. Când dubla fluorescență a probelor etichetate este intactă, fluorescența markerilor este suprimată prin
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
efectelor de tip Forster. În timpul PCR, proba hibridizează la o secvență țintă și este scindată prin activarea polimerazei termostabile Z05. Odată ce markerii și coloranții sunt eliberați și separați, reacția nu mai are loc, iar activitatea fluorescentă a markerului este crescută. Amplificarea ADN-ului VHB și a ADN-ului VHB standard sunt evaluate independent la diferite lungimi de undă. Acest proces se repetă pentru un număr determinat de cicluri, fiecare ciclu sporind efectiv intensitatea emisiilor coloranților individuali și permite identificarea independentă a
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
este legată de cantitatea de materie primă de la începutul PCR. d) Dozarea probelor de testare Testarea VHB de către analizor se bazează pe rezultate cantitative precise pentru un interval dinamic foarte larg deoarece monitorizarea ampliconului se efectuează în faza exponențială de amplificare. Cel mai mare titru de ADN-VHB dintr-o probă crește peste nivelul de fluorescență de bază. Deoarece cantitatea de ADN-VHB standard (QS) este constantă între toate probele, fluorescența probei VHB QS ar trebui să apară în același ciclu pentru toate
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
ADN-VHB dintr-o probă crește peste nivelul de fluorescență de bază. Deoarece cantitatea de ADN-VHB standard (QS) este constantă între toate probele, fluorescența probei VHB QS ar trebui să apară în același ciclu pentru toate probele. În cazul în care amplificarea QS și detectarea este afectată de inhibiție sau de o probă saracă în ADN, aspectul fluorescenței va apărea mai târziu, permițând astfel ca titrul calculat de ADN-VHB țintă să fie ajustate în consecință. Aspectul semnalului fluorescent specific este raportat ca
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
la o concentrație cunoscută. Standardul VHB este o plasmidă ADN infecțioasă non-liniară care conține fragmente de VHB cu primele regiuni de legare identice cu secvența VHB țintă. Standardul VHB generează un produs de 8. Virusuri cu potențial oncogen pentru om amplificare VHB de aceeași lungime și compoziția de bază ca ADN-ul VHB țintă. Detectarea regiunii de legare a ADN-ului VHB standard este diferită de faza de cuantificare a ampliconului VHB țintă. În faza de reîncălzire a PCR pe analizor
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
nivelul genei polimerazei ADN VHB. Virusul hepatitei B are un genom ADN circular parțial dublu catenar. Primul pas este izolarea ADN-ului VHB care va fi amplificat prin PCR utilizând primeri specifici biotinilați. Prima etapă de PCR utilizează primeri pentru amplificarea domeniilor B și C din cadrul polimerazei ADN VHB. Prin încălzire se realizează denaturarea ADN-ului VHB dublu catenar pentru a expune secvențele complementare primerilor. Acești primeri oligonucleotidici sunt complementari unor regiuni de la nivelul ADN VHB. Consecutiv răcirii la o temperatură
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
ADN-ului VHB dublu catenar pentru a expune secvențele complementare primerilor. Acești primeri oligonucleotidici sunt complementari unor regiuni de la nivelul ADN VHB. Consecutiv răcirii la o temperatură specifică, primerii se vor cupla la nivelul secvențelor specifice (alipire). Din cauză că produsul de amplificare este în general insuficient, o a doua etapă de PCR (nested PCR) este necesară. Principiul acestei amplificări este identic cu cel anterior cu excepția faptului că ADN-ul amplificat este produsul din prima etapa de PCR, iar primerii sunt înlocuiți de
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
regiuni de la nivelul ADN VHB. Consecutiv răcirii la o temperatură specifică, primerii se vor cupla la nivelul secvențelor specifice (alipire). Din cauză că produsul de amplificare este în general insuficient, o a doua etapă de PCR (nested PCR) este necesară. Principiul acestei amplificări este identic cu cel anterior cu excepția faptului că ADN-ul amplificat este produsul din prima etapa de PCR, iar primerii sunt înlocuiți de primeri nested biotinilați. Reacția se bazează pe principiul revers hibridizării. După amplificare, ADN-ul biotinilat generat de
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
PCR) este necesară. Principiul acestei amplificări este identic cu cel anterior cu excepția faptului că ADN-ul amplificat este produsul din prima etapa de PCR, iar primerii sunt înlocuiți de primeri nested biotinilați. Reacția se bazează pe principiul revers hibridizării. După amplificare, ADN-ul biotinilat generat de AgHBs este hibridizat cu oligonucleotide specifice care tapetează stripurile sub forma unor linii paralele. După hibridizarea ADN-ului se adaugă streptavidina marcată cu fosfatază alcalină care se leagă de hibridul biotinilat format anterior. Se adaugă
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
Stripurile de genotipare INNOLiPA VHB conțin o linie marker roșie, două linii de control și 14 linii paralele la nivelul cărora sunt fixate probele oligonucleotidice. Linia de control a conjugatului verifică dezvoltarea culorii în cadrul reacției, iar linia de control a amplificării conține probe universale VHB care verifică prezența materialului VHB amplificat. 8.1.2.3. Patogeneza infecției cu virusul hepatitei B VHB, un virus ADN parțial dublu catenar aparținând Hepadnaviridae, este factorul de risc cel mai important pentru dezvoltarea HCC. Aproximativ
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]
-
N-myc). Rămâne a se stabili dacă aceste diferențe izbitoare sunt legate de factorii determinanți virali sau factorii de specie. Au fost notate multe relații interesante între caracteristicile genetice moleculare și citogenetice ale carcinomului hepatocelular în Taiwan. În primul rând, demonstrarea amplificării și a supraexprimării protooncogenelor cunoscute, cum ar fi ciclina D1 și c-myc în HCC umane, activarea c-myc apărând mai frecvent la pacienții tineri cu nivele serice crescute de α-fetoproteină (AFP) sau cu infecție VHB. În al doilea rând, pentru că analiza
Oncogeneza virală by Petre Calistru, Radu Iftimovici, Ileana Constantinescu, Petre-Adrian Muțiu () [Corola-publishinghouse/Science/91991_a_92486]