942 matches
-
3), se urmează instrucțiunile producătorului. În caz contrar, se urmează procedura descrisă în continuare: (a) Se amestecă picăturile unei suspensii de anticorpi și de exsudat bacterian marcate (circa 5 μl în fiecare caz) pe ferestrele lamelor de testare cu multe godeuri. (b) Se prepară frotiuri de control pozitiv și negativ din suspensii biovar 2 de R. solanacearum și dintr-o sușă heterologă. (c) Se observă aglutinarea în eșantioanele pozitive după o amestecare ușoară timp de cincisprezece secunde. 4. Izolarea selectivă 4
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
de extracte de eșantioane care au dat rezultate negative la testele anterioare de detectare a R. solanacearum. Materialele de control pozitiv și negativ standardizate disponibile pentru acest test sunt prevăzute în apendicele 3. Se folosesc, pentru microscop, lame cu multe godeuri având, de preferință, zece ferestre cu diametru de cel puțin 6 mm. Materialul de control se testează în același mod ca și eșantioanele. 5.1. Lamele de test se prepară folosind una dintre următoarele metode: (i) Extracte concentrate cu relativ
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
pe perioada necesară (cel mult trei luni) înainte de un nou test. 5.3. Procedura testului de imunofluorescență (i) În conformitate cu metoda de pregătire a lamelor de test indicată la punctul 5.1 (i): Se prepară un set de diluții duble. Primul godeu ar trebui să fie de 1/2 din titru (T/2), celelalte fiind de 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T). (ii) În conformitate cu metoda de pregătire a
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
un bloc de încălzire pentru a reduce rezultatele nespecifice în anumite cazuri). (2) Se adaugă un volum egal de tampon dublu concentrat (apendicele 4) și se omogenizează în agitator. (3) Se aplică 100 μl alicote în fiecare dintre minimum două godeuri ale plăcii de microtitrare (de exemplu, Nunc-Polysorp sau echivalent) și se incubează o oră la 37 °C sau peste noapte la 4 °C. (4) Se scot extractele din godeuri. Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4), lăsând
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
3) Se aplică 100 μl alicote în fiecare dintre minimum două godeuri ale plăcii de microtitrare (de exemplu, Nunc-Polysorp sau echivalent) și se incubează o oră la 37 °C sau peste noapte la 4 °C. (4) Se scot extractele din godeuri. Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4), lăsând ultima soluție de spălare cel puțin cinci minute în godeuri. (5) Se prepară diluția corespunzătoare a antiserului anti-R. solanacearum în tampon de saturație (apendicele 4). Pentru anticorpii comerciali validați
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
100 μl alicote în fiecare dintre minimum două godeuri ale plăcii de microtitrare (de exemplu, Nunc-Polysorp sau echivalent) și se incubează o oră la 37 °C sau peste noapte la 4 °C. (4) Se scot extractele din godeuri. Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4), lăsând ultima soluție de spălare cel puțin cinci minute în godeuri. (5) Se prepară diluția corespunzătoare a antiserului anti-R. solanacearum în tampon de saturație (apendicele 4). Pentru anticorpii comerciali validați, se folosesc diluțiile
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
și se incubează o oră la 37 °C sau peste noapte la 4 °C. (4) Se scot extractele din godeuri. Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4), lăsând ultima soluție de spălare cel puțin cinci minute în godeuri. (5) Se prepară diluția corespunzătoare a antiserului anti-R. solanacearum în tampon de saturație (apendicele 4). Pentru anticorpii comerciali validați, se folosesc diluțiile recomandate (de obicei, de două ori mai concentrate decât titrul). (6) Se aplică 100 μl în fiecare godeu
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
godeuri. (5) Se prepară diluția corespunzătoare a antiserului anti-R. solanacearum în tampon de saturație (apendicele 4). Pentru anticorpii comerciali validați, se folosesc diluțiile recomandate (de obicei, de două ori mai concentrate decât titrul). (6) Se aplică 100 μl în fiecare godeu și se incubează o oră la 37 °C. (7) Se scoate soluția de anticorpi din godeuri și se spală în conformitate cu cele indicate anterior (punctul 4). (8) Se prepară diluția corespunzătoare de conjugați secundari de anticorpi și de fosfatază alcalină în
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
Pentru anticorpii comerciali validați, se folosesc diluțiile recomandate (de obicei, de două ori mai concentrate decât titrul). (6) Se aplică 100 μl în fiecare godeu și se incubează o oră la 37 °C. (7) Se scoate soluția de anticorpi din godeuri și se spală în conformitate cu cele indicate anterior (punctul 4). (8) Se prepară diluția corespunzătoare de conjugați secundari de anticorpi și de fosfatază alcalină în tampon de saturație. Se adaugă 100 μl în fiecare godeu și se incubează o oră la
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
Se scoate soluția de anticorpi din godeuri și se spală în conformitate cu cele indicate anterior (punctul 4). (8) Se prepară diluția corespunzătoare de conjugați secundari de anticorpi și de fosfatază alcalină în tampon de saturație. Se adaugă 100 μl în fiecare godeu și se incubează o oră la 37 °C. (9) Se scoate conjugatul de anticorpi din godeuri și se spală în conformitate cu cele indicate anterior (punctul 4). (10) Se adaugă 100 μl de soluție de substrat de fosfatază alcalină (apendicele 4) în
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
8) Se prepară diluția corespunzătoare de conjugați secundari de anticorpi și de fosfatază alcalină în tampon de saturație. Se adaugă 100 μl în fiecare godeu și se incubează o oră la 37 °C. (9) Se scoate conjugatul de anticorpi din godeuri și se spală în conformitate cu cele indicate anterior (punctul 4). (10) Se adaugă 100 μl de soluție de substrat de fosfatază alcalină (apendicele 4) în fiecare godeu. Se incubează în întuneric la temperatura ambiantă și se măsoară absorbanța la 405 nm
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
se incubează o oră la 37 °C. (9) Se scoate conjugatul de anticorpi din godeuri și se spală în conformitate cu cele indicate anterior (punctul 4). (10) Se adaugă 100 μl de soluție de substrat de fosfatază alcalină (apendicele 4) în fiecare godeu. Se incubează în întuneric la temperatura ambiantă și se măsoară absorbanța la 405 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute. (b) DAS-ELISA (1) Se prepară diluția corespunzătoare de imunoglobuline policlonale anti-R. solanacearum în tampon concentrat cu pH
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
absorbanța la 405 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute. (b) DAS-ELISA (1) Se prepară diluția corespunzătoare de imunoglobuline policlonale anti-R. solanacearum în tampon concentrat cu pH 9,6 (apendicele 4). Se adaugă 200 μl în fiecare godeu. Se incubează timp de patru-cinci ore la 37 °C sau timp de 16 ore la 4 °C. (2) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). Se adaugă 190 μl de extract de eșantion în cel puțin două
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
imunoglobuline policlonale anti-R. solanacearum în tampon concentrat cu pH 9,6 (apendicele 4). Se adaugă 200 μl în fiecare godeu. Se incubează timp de patru-cinci ore la 37 °C sau timp de 16 ore la 4 °C. (2) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). Se adaugă 190 μl de extract de eșantion în cel puțin două godeuri. De asemenea, se adaugă eșantioane de control pozitiv și negativ în două godeuri pe fiecare placă. Se incubează timp de
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
Se incubează timp de patru-cinci ore la 37 °C sau timp de 16 ore la 4 °C. (2) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). Se adaugă 190 μl de extract de eșantion în cel puțin două godeuri. De asemenea, se adaugă eșantioane de control pozitiv și negativ în două godeuri pe fiecare placă. Se incubează timp de șaisprezece ore la 4 °C. (3) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (4) Se prepară o
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
ore la 4 °C. (2) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). Se adaugă 190 μl de extract de eșantion în cel puțin două godeuri. De asemenea, se adaugă eșantioane de control pozitiv și negativ în două godeuri pe fiecare placă. Se incubează timp de șaisprezece ore la 4 °C. (3) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (4) Se prepară o diluție corespunzătoare de anticorpi monoclonali specifici R. solanacearum în PBS (apendicele 4) conținând
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
adaugă 190 μl de extract de eșantion în cel puțin două godeuri. De asemenea, se adaugă eșantioane de control pozitiv și negativ în două godeuri pe fiecare placă. Se incubează timp de șaisprezece ore la 4 °C. (3) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (4) Se prepară o diluție corespunzătoare de anticorpi monoclonali specifici R. solanacearum în PBS (apendicele 4) conținând, de asemenea, 0,5 % seralbumină bovină (BSA) și se adaugă 190 μl în fiecare godeu. Se
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (4) Se prepară o diluție corespunzătoare de anticorpi monoclonali specifici R. solanacearum în PBS (apendicele 4) conținând, de asemenea, 0,5 % seralbumină bovină (BSA) și se adaugă 190 μl în fiecare godeu. Se incubează două ore la 37 °C. (5) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (6) Se prepară o diluție corespunzătoare de imunoglobuline antișoarece conjugate cu fosfatază alcalină în PBS. Se adaugă 190 μl în fiecare godeu
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
prepară o diluție corespunzătoare de anticorpi monoclonali specifici R. solanacearum în PBS (apendicele 4) conținând, de asemenea, 0,5 % seralbumină bovină (BSA) și se adaugă 190 μl în fiecare godeu. Se incubează două ore la 37 °C. (5) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (6) Se prepară o diluție corespunzătoare de imunoglobuline antișoarece conjugate cu fosfatază alcalină în PBS. Se adaugă 190 μl în fiecare godeu. Se incubează două ore la 37 °C. (7) Se spală godeurile
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
godeu. Se incubează două ore la 37 °C. (5) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (6) Se prepară o diluție corespunzătoare de imunoglobuline antișoarece conjugate cu fosfatază alcalină în PBS. Se adaugă 190 μl în fiecare godeu. Se incubează două ore la 37 °C. (7) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (8) Se prepară o soluție de substrat al fosfatazei alcaline conținând 1 mg de p-nitrofenil fosfat pe ml de substanță tamponată (apendicele
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (6) Se prepară o diluție corespunzătoare de imunoglobuline antișoarece conjugate cu fosfatază alcalină în PBS. Se adaugă 190 μl în fiecare godeu. Se incubează două ore la 37 °C. (7) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (8) Se prepară o soluție de substrat al fosfatazei alcaline conținând 1 mg de p-nitrofenil fosfat pe ml de substanță tamponată (apendicele 4). Se adaugă 200 μl în fiecare godeu. Se incubează în
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
7) Se spală godeurile de trei ori cu PBS-Tween (apendicele 4). (8) Se prepară o soluție de substrat al fosfatazei alcaline conținând 1 mg de p-nitrofenil fosfat pe ml de substanță tamponată (apendicele 4). Se adaugă 200 μl în fiecare godeu. Se incubează în întuneric la temperatura ambiantă și se măsoară absorbanța la 40 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute. Interpretarea rezultatelor testelor ELISA Testul ELISA este negativ atunci când densitatea optică (DO) medie a godeurilor eșantionului dublu
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
în fiecare godeu. Se incubează în întuneric la temperatura ambiantă și se măsoară absorbanța la 40 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute. Interpretarea rezultatelor testelor ELISA Testul ELISA este negativ atunci când densitatea optică (DO) medie a godeurilor eșantionului dublu este mai mică decât densitatea optică dublă a godeurilor controlului negativ, cu condiția ca densitatea optică a controlului pozitiv să fie întotdeauna mai mare decât 1,0 (după 90 de minute de incubare cu substratul) și mai mare
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
se măsoară absorbanța la 40 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute. Interpretarea rezultatelor testelor ELISA Testul ELISA este negativ atunci când densitatea optică (DO) medie a godeurilor eșantionului dublu este mai mică decât densitatea optică dublă a godeurilor controlului negativ, cu condiția ca densitatea optică a controlului pozitiv să fie întotdeauna mai mare decât 1,0 (după 90 de minute de incubare cu substratul) și mai mare decât DO dublă obținută pentru extractele de eșantioane de control negativ
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
să fie întotdeauna mai mare decât 1,0 (după 90 de minute de incubare cu substratul) și mai mare decât DO dublă obținută pentru extractele de eșantioane de control negativ. Testul ELISA este pozitiv atunci când densitatea optică (DO) medie a godeurilor eșantionului dublu este mai mare decât densitatea optică dublă a godeurilor controlului negativ, cu condiția ca DO pentru toate godeurile eșantioanelor de control negativ să fie mai mică decât de două ori DO obținută pentru godeurile eșantioanelor de control pozitiv
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]