3,282 matches
-
evită orice vaporizare sau vărsare care ar putea determina o contaminare încrucișată. Se elimină cu atenție excesul de umiditate cu ajutorul hârtiei sugative; 4.3.4. se așază lamele pe hârtie umedă. Se acoperă ferestrele de test cu conjugat FITC la diluția utilizată la titrare. Cantitatea de conjugat aplicată pe ferestre trebuie să fie identică cu cantitatea de anticorpi utilizată; 4.3.5. se incubează lamele pe hârtie umedă și sub capac-clopot timp de 30 de minute, la temperatura mediului ambiant (18-25
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
un număr redus de celule se observă cel puțin 40 de câmpuri microscopice. Se începe prin a se controla lama martorului pozitiv. Celulele trebuie să prezinte o fluorescență vie și să fie complet colorate la titrul de anticorp sau de diluție de lucru determinat. În cazul unei colorări anormale, testul IF (secțiunea 4) trebuie repetat. 4.4.2. Se caută în ferestrele lamelor de test prezența celulelor care prezintă o fluorescență vie și o morfologie caracteristică pentru C. m. ssp. sepedonicus
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
vie și o morfologie caracteristică pentru C. m. ssp. sepedonicus (a se vedea site-ul web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescenței trebuie să fie echivalentă cu cea a sușei martor pozitiv pentru o diluție identică de anticorpi. Celulele a căror colorare este incompletă sau care prezintă o fluorescență slabă nu trebuie luate în considerare. La cea mai mică suspiciune de contaminare, testul trebuie repetat. Acest lucru se poate întâmpla în cazul în care toate
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
punct de vedere morfologic și populații de bacterii saprofite care provoacă reacții încrucișate și au dimensiune și morfologie similare cu C. m. ssp. sepedonicus. 4.4.4. Numai celulele fluorescente care au o dimensiune și o morfologie caracteristice titrului sau diluției de lucru a anticorpilor menționați la punctul 4.3 trebuie să fie luate în considerare. 4.4.5. Interpretarea testului de imunofluorescență: (i) În cazul în care proba conține celule care prezintă o fluorescență vie și o morfologie caracteristică, se
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
martori care conțin între 103 și 104 celule de agent patogen pe mililitru. 6.2. PCR 6.2.1. Se prepară matricele de test și de control pentru PCR, urmând protocoalele validate (a se vedea apendicele 6). Se prepară o diluție zecimală din extractul de ADN provenit din probă (1:10 în apă ultrapură). 6.2.2. Se prepară amestecul reactiv pentru PCR într-un mediu lipsit de orice contaminare, în conformitate cu protocoalele publicate (a se vedea apendicele 6). Protocolul PCR validat
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
în mod direct pe baza extractului concentrat de țesut de tubercul sau de tulpină (obținut la secțiunea 3.1.6 sau 3.2.5). Izolarea directă a C. m. ssp. sepedonicus rămâne posibilă pe mediu selectiv și pe baza unei diluții adecvate de extract concentrat, repus în suspensie, de conuri de cartofi prelevate de la stolonul sau tulpina de cartof. Izolările trebuie practicate pe toți tuberculii sau pe toate segmentele de tulpini de cartofi și pe toate pătlăgelele vinete care nu prezintă
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
sau PCR efectuat pe proba compozită (a se vedea secțiunea 7.10) a dat un rezultat pozitiv. După caz, tulpinile de pătlăgele vinete trebuie să fie macerate, în conformitate cu metoda descrisă la secțiunea 3.1.3. Ca martori pozitivi, se prepară diluții la a zecea parte dintr-o suspensie de 106 ufc/ml de C. m. ssp. sepedonicus (de exemplu, NCPPB 4053 sau PD 406). Pentru a evita orice posibilitate de contaminare, martorii pozitivi se prepară la distanță de probele care trebuie
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
testează la fel ca și probele. 8.1. Desfășurare pe medii selective 8.1.1. Pe baza a 100 μl de alicotă de probă de extract concentrat de cartof repus în suspensie sau de sevă de pătlăgea vânătă, se efectuează diluții la a zecea parte într-un tampon de extract concentrat (a se vedea apendicele 3). 8.1.2. Tentativele de izolare pe bază de extract concentrat nediluat de cartof se soldează, în general, cu eșecuri datorită dificultăților pe care le
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
se soldează, în general, cu eșecuri datorită dificultăților pe care le prezintă cultura de Cms și a concurenței saprofitelor. Deoarece bacteria este în general prezentă în masă în țesuturile infectate, cel mai adesea este posibil să se evacueze saprofitele prin diluție, păstrând totodată agentul patogen. Prin urmare, se recomandă să se recurgă la tehnica de desfășurare pe lamă și să se desfășoare, cu ajutorul unui aplicator ("crosă de hockey"), 100 μl din fiecare probă, cu diluții de 1/100-1/10 000, pe
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
posibil să se evacueze saprofitele prin diluție, păstrând totodată agentul patogen. Prin urmare, se recomandă să se recurgă la tehnica de desfășurare pe lamă și să se desfășoare, cu ajutorul unui aplicator ("crosă de hockey"), 100 μl din fiecare probă, cu diluții de 1/100-1/10 000, pe un mediu MTNA sau NCP-88 (a se vedea apendicele 5). Nota bene: O altă strategie poate consta în desfășurarea alicotei inițiale de 100 μl de extract concentrat de cartof pe o primă lamă de
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
primă lamă de agar cu ajutorul unui aplicator, întinderea în striuri pe o a doua lamă a restului rămas pe aplicator și repetarea procedurii pe o a treia lamă. Aplicatorul permite astfel ca pe lame să se obțină un efect de diluție. 8.1.3. Se incubează lamele la adăpost de lumină și la temperaturi cuprinse între 21 °C și 23 °C. 8.1.4. Prima examinare a lamelor, cu numărarea, în raport cu lamele martori, a eventualelor colonii cu aspect asemănător cu C.
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
de salicină - Colorare Gram (a se vedea apendicele 9) + 9.2. Test de imunofluorescență (IF) (a) Se prepară o suspensie de aproximativ 106 celule pe mililitru într-un tampon de imunofluorescență (a se vedea apendicele 3). (b) Se prepară o diluție la jumătate dintr-un antiser adecvat. (c) Se urmează procedura testului de imunofluorescență (a se vedea secțiunea 4). (d) Pentru ca un test IF să fie pozitiv, titrul obținut cu cultura trebuie să fie echivalent cu cel obținut cu martorul pozitiv
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
concentrat repus în suspensie în zece microfiole sterile de 1,5 ml. Se însămânțează prima microfiolă cu 100 μl din suspensia de C. m. ssp. sepedonicus. Se omogenizează prin agitare. Se stabilesc niveluri de contaminare la a zecea parte, urmând diluția în următoarele cinci microfiole. Cele șase microfiole contaminate vor fi utilizate ca martori pozitivi. Cele patru microfiole necontaminate vor fi utilizate ca martori negativi. Microfiolele se etichetează în consecință. Se prepară alicote de 100 μl în microfiole sterile de 1
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
PVP-40) Legătură de inhibitori de PCR 50 g *A se utiliza cu metoda de extragere prin omogenizare. 1.2. Tampon de extract concentrat (tampon fosfatat la 10 mM, pH 7,2) Tamponul menționat este utilizat pentru repunerea în suspensie și diluția extractelor de stoloni de tuberculi de cartofi concentrați prin centrifugare. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g Apă distilată 1,00 l Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul și se sterilizează cu autoclavă timp de 15
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
se verifică pH-ul și se sterilizează cu autoclavă timp de 15 minute la 121 °C. 2. Tampoane pentru testele de imunofluorescență 2.1. Tampon IF (tampon cu fosfat la 10 mM, pH 7,2) Tamponul menționat este utilizat pentru diluția anticorpilor. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g NaCl 8,0 g Apă distilată 1,0 l Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul și se sterilizează cu autoclavă timp de 15 minute la 121 °C. 2
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
etc.) 3. Se calculează celulele fluorescente caracteristice pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie (N) N = C x 1 000/y x F unde: y = volumul de extract concentrat repus în suspensie pe fiecare fereastră și F = factorul de diluție al extractului concentrat repus în suspensie Apendicele 5 Medii de izolare și de cultură ale C. m. ssp. sepedonicus (a) Medii de cultură de tip general Agar nutritiv Agar nutritiv (Difco) 23,0 g Apă distilată 1,0 l Se
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
sau de alte plante gazdă ofilite. Se pune în suspensie, într-un volum mic de apă distilată sterilă sau într-un tampon fosfat de 50 mM (apendicele 4). Se lasă cinci-zece minute pe masă. (b) Se prepară o serie de diluții zecimale ale suspensiei. (c) Se transferă 50-100 μl de suspensie și de diluții într-un mediu nutritiv general (NA, YPGA și SPA; a se vedea apendicele 2) și/sau în mediul de tetrazoliu Kelman (apendicele 2) și/sau în mediul
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
mic de apă distilată sterilă sau într-un tampon fosfat de 50 mM (apendicele 4). Se lasă cinci-zece minute pe masă. (b) Se prepară o serie de diluții zecimale ale suspensiei. (c) Se transferă 50-100 μl de suspensie și de diluții într-un mediu nutritiv general (NA, YPGA și SPA; a se vedea apendicele 2) și/sau în mediul de tetrazoliu Kelman (apendicele 2) și/sau în mediul selectiv validat (de exemplu, SMSA; a se vedea apendicele 2). Se întinde sau
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
atinsă în cazul în care se folosesc extracte de eșantioane proaspăt preparate. Cu toate acestea, metoda se aplică, de asemenea, utilizărilor de extracte păstrate sub glicerol la o temperatură cuprinsă între - 68 și - 86 °C. Se prepară, pentru control pozitiv, diluții zecimale de suspensie de 106 ufc/ml dintr-o sușă virulentă biovar 2 de R. solanacearum (de exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Pentru a evita orice posibilitate de contaminare, controalele pozitive se prepară complet separat de eșantioanele de
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
și eșantioanele. 4.1.1. Testul se efectuează cu ajutorul unei tehnici corespunzătoare prin diluare și însămânțare cu scopul de a asigura diluarea întregii populații care formează colonii de saprofite. Se folosesc 50-100 μl din fiecare eșantion de extract și fiecare diluție. 4.1.2. Plăcile se incubează la 28 °C. Citirea plăcilor se face după 48 ore, iar apoi zilnic pe o perioadă de până la șase zile. Coloniile tipice de R. solanacearum în mediul nutritiv SMSA sunt de culoare alb-lăptos, plate
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
o sursă validată de anticorpi de R. solanacearum (a se vedea website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Se recomandă stabilirea titrului pentru fiecare lot nou de anticorpi. Titrul se definește ca fiind cea mai mare diluție la care se obține o reacție optimă atunci când se testează o suspensie de 105-106 celule pe ml din sușa omologă de R. solanacearum folosind un conjugat corespunzător de izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Toate antiserurile policlonale validate au
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
105-106 celule pe ml din sușa omologă de R. solanacearum folosind un conjugat corespunzător de izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Toate antiserurile policlonale validate au un titru de imunofluorescență de cel puțin 1: 2 000. La efectuarea testului, diluțiile de lucru ale anticorpilor trebuie să fie aproximativ egale sau egale cu cele ale titrului. Testul trebuie efectuat cu extracte de eșantion proaspăt preparate. După caz, se pot folosi și extracte conservate în soluție de glicerol la o temperatură cuprinsă
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
se prepară folosind una dintre următoarele metode: (i) Extracte concentrate cu relativ puțin amidon: Se pipetează un volum standard (15 μl este adecvat unei ferestre de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru ferestre cu diametru mai mare) dintr-o diluție de 1/100 de extract concentrat resuspendat în prima fereastră. Apoi, se pipetează un volum similar de extract concentrat nediluat (1/1) în ferestrele rămase din primul șir. Al doilea șir poate fi folosit ca duplicat sau pentru un al
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
similar de extract concentrat nediluat (1/1) în ferestrele rămase din primul șir. Al doilea șir poate fi folosit ca duplicat sau pentru un al doilea eșantion, în conformitate cu cele indicate în figura 1. (ii) Pentru alte extracte concentrate: Se pregătesc diluții zecimale (1/10, 1/100) din extractul concentrat resuspendat în tamponul de concentrare. Se pipetează un volum standard (15 μl corespund unei ferestre de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru ferestre cu un diametru mai mare) din extractul concentrat
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]
-
100) din extractul concentrat resuspendat în tamponul de concentrare. Se pipetează un volum standard (15 μl corespund unei ferestre de 6 mm diametru - volumul se mărește pentru ferestre cu un diametru mai mare) din extractul concentrat resuspendat și din fiecare diluție într-un șir de ferestre. Șirul rămas poate fi folosit ca duplicat sau pentru un al doilea eșantion, în conformitate cu cele indicate în figura 2. 5.2. Se lasă picăturile să se usuce la temperatura ambiantă sau prin încălzire la o
32006L0063-ro () [Corola-website/Law/295071_a_296400]