3,199 matches
-
m. ssp. sepedonicus folosind un conjugat adecvat de izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Soluția brută de anticorpi policlonali sau monoclonali trebuie să prezinte un titru de imunofluorescență de cel puțin 1:2 000. În momentul efectuării testului, diluția/diluțiile de lucru ale anticorpilor trebuie să fie aproximativ egale cu jumătatea titrului. Se folosesc anticorpi validați (a se vedea site-ul web la adresa: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Testul trebuie efectuat pe extracte de probă
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
similară de extract concentrat nediluat (1/1) pe ferestrele rămase din acel șir. Șirul următor poate fi folosit ca duplicat sau poate servi pentru o a doua probă, astfel cum se indică în figura 1; (ii) alte extracte: se prepară diluțiile zecimale (la 1/10, la 1/100 și la 1/1 000) din extractul concentrat repus în suspensie în soluția tampon. Se depune cu pipeta pe un șir de ferestre o cantitate standard (15 μl sunt suficienți pentru un diametru
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
un șir de ferestre o cantitate standard (15 μl sunt suficienți pentru un diametru al ferestrei de 6 mm; pentru ferestrele cu un diametru mai mare se alege o cantitate mai mare) de suspensie de extract pur și de fiecare diluție. Șirul următor poate fi folosit ca duplicat sau poate servi pentru o a doua probă, astfel cum se indică în figura 2. 4.2. Se usucă picăturile la temperatura mediului ambiant sau prin încălzire la temperaturi cuprinse între 40 °C
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
pentru cea mai scurtă perioadă posibilă (maximum 3 luni) înainte de efectuarea unui alt test. 4.3. Procedura testului de imunofluorescență: (i) în conformitate cu metoda de preparare a lamelor de test, indicată la punctul 4.1 (i): se prepară o serie de diluții pe jumătate de anticorp într-un tampon de imunofluorescență. Primul godeu trebuie să primească 1/2 din titru (T/2), celelalte 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titrul (T) și de două ori titrul
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
T/2), celelalte 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titrul (T) și de două ori titrul (2T); (ii) în conformitate cu metoda de preparare a lamelor de test, indicată la punctul 4.1 (ii): se prepară diluția de lucru de anticorp într-un tampon de imunofluorescență. Diluția de lucru are efect asupra specificității. Figura 1. Prepararea lamei de test în conformitate cu punctele 4.1 (i) și 4.3 (i) Diluția de extract concentrat repus în suspensie 1/100
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
2 din titru (T/2), titrul (T) și de două ori titrul (2T); (ii) în conformitate cu metoda de preparare a lamelor de test, indicată la punctul 4.1 (ii): se prepară diluția de lucru de anticorp într-un tampon de imunofluorescență. Diluția de lucru are efect asupra specificității. Figura 1. Prepararea lamei de test în conformitate cu punctele 4.1 (i) și 4.3 (i) Diluția de extract concentrat repus în suspensie 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 Diluție de
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
indicată la punctul 4.1 (ii): se prepară diluția de lucru de anticorp într-un tampon de imunofluorescență. Diluția de lucru are efect asupra specificității. Figura 1. Prepararea lamei de test în conformitate cu punctele 4.1 (i) și 4.3 (i) Diluția de extract concentrat repus în suspensie 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 Diluție de extract concentrat repus în suspensie (T = titru) T/2 T/4 T/2 T 2T Diluție pe jumătate a antiserului/anticorpului ***[PLEASE
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
imunofluorescență. Diluția de lucru are efect asupra specificității. Figura 1. Prepararea lamei de test în conformitate cu punctele 4.1 (i) și 4.3 (i) Diluția de extract concentrat repus în suspensie 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 Diluție de extract concentrat repus în suspensie (T = titru) T/2 T/4 T/2 T 2T Diluție pe jumătate a antiserului/anticorpului ***[PLEASE INSERT FIGURE AND THE FOLLOWING TEXT IN RO LANGUAGE]*** échantillon 1 = eșantion 1 double de l'échantillon
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
1 (i) și 4.3 (i) Diluția de extract concentrat repus în suspensie 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 Diluție de extract concentrat repus în suspensie (T = titru) T/2 T/4 T/2 T 2T Diluție pe jumătate a antiserului/anticorpului ***[PLEASE INSERT FIGURE AND THE FOLLOWING TEXT IN RO LANGUAGE]*** échantillon 1 = eșantion 1 double de l'échantillon 1 ou de l'échantillon 2 = dublul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 Figura 2. Prepararea lamei
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
TEXT IN RO LANGUAGE]*** échantillon 1 = eșantion 1 double de l'échantillon 1 ou de l'échantillon 2 = dublul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 Figura 2. Prepararea lamei de test în conformitate cu punctele 4.1 (ii) și 4.3 (ii) Diluția de lucru de antiser/anticorp 1/1 1/10 1/100 gol gol Diluție la a zecea parte de extract concentrat repus în suspensie ***[PLEASE INSERT FIGURE AND THE FOLLOWING TEXT IN RO LANGUAGE]*** échantillon 1 = eșantion 1 double de
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
de l'échantillon 2 = dublul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 Figura 2. Prepararea lamei de test în conformitate cu punctele 4.1 (ii) și 4.3 (ii) Diluția de lucru de antiser/anticorp 1/1 1/10 1/100 gol gol Diluție la a zecea parte de extract concentrat repus în suspensie ***[PLEASE INSERT FIGURE AND THE FOLLOWING TEXT IN RO LANGUAGE]*** échantillon 1 = eșantion 1 double de l'échantillon 1 ou de l'échantillon 2 = dublul eșantionului 1 sau al eșantionului
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
eșantion 1 double de l'échantillon 1 ou de l'échantillon 2 = dublul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 4.3.1. Se așază lamele pe hârtie umedă. Se acoperă complet fiecare fereastră de test cu una sau mai multe diluții de anticorpi. Cantitatea de anticorpi aplicată pe fiecare fereastră trebuie să fie cel puțin egală cu volumul de extract aplicat. În absența instrucțiunilor specifice ale furnizorilor de anticorpi, se aplică următoarea procedură: 4.3.2. se incubează lamele pe hârtie
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
evită orice vaporizare sau vărsare care ar putea determina o contaminare încrucișată. Se elimină cu atenție excesul de umiditate cu ajutorul hârtiei sugative; 4.3.4. se așază lamele pe hârtie umedă. Se acoperă ferestrele de test cu conjugat FITC la diluția utilizată la titrare. Cantitatea de conjugat aplicată pe ferestre trebuie să fie identică cu cantitatea de anticorpi utilizată; 4.3.5. se incubează lamele pe hârtie umedă și sub capac-clopot timp de 30 de minute, la temperatura mediului ambiant (18-25
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
un număr redus de celule se observă cel puțin 40 de câmpuri microscopice. Se începe prin a se controla lama martorului pozitiv. Celulele trebuie să prezinte o fluorescență vie și să fie complet colorate la titrul de anticorp sau de diluție de lucru determinat. În cazul unei colorări anormale, testul IF (secțiunea 4) trebuie repetat. 4.4.2. Se caută în ferestrele lamelor de test prezența celulelor care prezintă o fluorescență vie și o morfologie caracteristică pentru C. m. ssp. sepedonicus
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
vie și o morfologie caracteristică pentru C. m. ssp. sepedonicus (a se vedea site-ul web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescenței trebuie să fie echivalentă cu cea a sușei martor pozitiv pentru o diluție identică de anticorpi. Celulele a căror colorare este incompletă sau care prezintă o fluorescență slabă nu trebuie luate în considerare. La cea mai mică suspiciune de contaminare, testul trebuie repetat. Acest lucru se poate întâmpla în cazul în care toate
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
punct de vedere morfologic și populații de bacterii saprofite care provoacă reacții încrucișate și au dimensiune și morfologie similare cu C. m. ssp. sepedonicus. 4.4.4. Numai celulele fluorescente care au o dimensiune și o morfologie caracteristice titrului sau diluției de lucru a anticorpilor menționați la punctul 4.3 trebuie să fie luate în considerare. 4.4.5. Interpretarea testului de imunofluorescență: (i) În cazul în care proba conține celule care prezintă o fluorescență vie și o morfologie caracteristică, se
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
martori care conțin între 103 și 104 celule de agent patogen pe mililitru. 6.2. PCR 6.2.1. Se prepară matricele de test și de control pentru PCR, urmând protocoalele validate (a se vedea apendicele 6). Se prepară o diluție zecimală din extractul de ADN provenit din probă (1:10 în apă ultrapură). 6.2.2. Se prepară amestecul reactiv pentru PCR într-un mediu lipsit de orice contaminare, în conformitate cu protocoalele publicate (a se vedea apendicele 6). Protocolul PCR validat
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
în mod direct pe baza extractului concentrat de țesut de tubercul sau de tulpină (obținut la secțiunea 3.1.6 sau 3.2.5). Izolarea directă a C. m. ssp. sepedonicus rămâne posibilă pe mediu selectiv și pe baza unei diluții adecvate de extract concentrat, repus în suspensie, de conuri de cartofi prelevate de la stolonul sau tulpina de cartof. Izolările trebuie practicate pe toți tuberculii sau pe toate segmentele de tulpini de cartofi și pe toate pătlăgelele vinete care nu prezintă
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
sau PCR efectuat pe proba compozită (a se vedea secțiunea 7.10) a dat un rezultat pozitiv. După caz, tulpinile de pătlăgele vinete trebuie să fie macerate, în conformitate cu metoda descrisă la secțiunea 3.1.3. Ca martori pozitivi, se prepară diluții la a zecea parte dintr-o suspensie de 106 ufc/ml de C. m. ssp. sepedonicus (de exemplu, NCPPB 4053 sau PD 406). Pentru a evita orice posibilitate de contaminare, martorii pozitivi se prepară la distanță de probele care trebuie
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
testează la fel ca și probele. 8.1. Desfășurare pe medii selective 8.1.1. Pe baza a 100 μl de alicotă de probă de extract concentrat de cartof repus în suspensie sau de sevă de pătlăgea vânătă, se efectuează diluții la a zecea parte într-un tampon de extract concentrat (a se vedea apendicele 3). 8.1.2. Tentativele de izolare pe bază de extract concentrat nediluat de cartof se soldează, în general, cu eșecuri datorită dificultăților pe care le
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
se soldează, în general, cu eșecuri datorită dificultăților pe care le prezintă cultura de Cms și a concurenței saprofitelor. Deoarece bacteria este în general prezentă în masă în țesuturile infectate, cel mai adesea este posibil să se evacueze saprofitele prin diluție, păstrând totodată agentul patogen. Prin urmare, se recomandă să se recurgă la tehnica de desfășurare pe lamă și să se desfășoare, cu ajutorul unui aplicator ("crosă de hockey"), 100 μl din fiecare probă, cu diluții de 1/100-1/10 000, pe
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
posibil să se evacueze saprofitele prin diluție, păstrând totodată agentul patogen. Prin urmare, se recomandă să se recurgă la tehnica de desfășurare pe lamă și să se desfășoare, cu ajutorul unui aplicator ("crosă de hockey"), 100 μl din fiecare probă, cu diluții de 1/100-1/10 000, pe un mediu MTNA sau NCP-88 (a se vedea apendicele 5). Nota bene: O altă strategie poate consta în desfășurarea alicotei inițiale de 100 μl de extract concentrat de cartof pe o primă lamă de
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
primă lamă de agar cu ajutorul unui aplicator, întinderea în striuri pe o a doua lamă a restului rămas pe aplicator și repetarea procedurii pe o a treia lamă. Aplicatorul permite astfel ca pe lame să se obțină un efect de diluție. 8.1.3. Se incubează lamele la adăpost de lumină și la temperaturi cuprinse între 21 °C și 23 °C. 8.1.4. Prima examinare a lamelor, cu numărarea, în raport cu lamele martori, a eventualelor colonii cu aspect asemănător cu C.
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
de salicină - Colorare Gram (a se vedea apendicele 9) + 9.2. Test de imunofluorescență (IF) (a) Se prepară o suspensie de aproximativ 106 celule pe mililitru într-un tampon de imunofluorescență (a se vedea apendicele 3). (b) Se prepară o diluție la jumătate dintr-un antiser adecvat. (c) Se urmează procedura testului de imunofluorescență (a se vedea secțiunea 4). (d) Pentru ca un test IF să fie pozitiv, titrul obținut cu cultura trebuie să fie echivalent cu cel obținut cu martorul pozitiv
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]
-
concentrat repus în suspensie în zece microfiole sterile de 1,5 ml. Se însămânțează prima microfiolă cu 100 μl din suspensia de C. m. ssp. sepedonicus. Se omogenizează prin agitare. Se stabilesc niveluri de contaminare la a zecea parte, urmând diluția în următoarele cinci microfiole. Cele șase microfiole contaminate vor fi utilizate ca martori pozitivi. Cele patru microfiole necontaminate vor fi utilizate ca martori negativi. Microfiolele se etichetează în consecință. Se prepară alicote de 100 μl în microfiole sterile de 1
32006L0056-ro () [Corola-website/Law/295065_a_296394]