408 matches
-
să coordoneze, pe baza consultărilor cu Comisia, metodele de diagnosticare a maladiei de Newcastle în statele membre, în special prin: (a) specificarea, deținerea și eliberarea de tulpini de virus al maladiei de Newcastle în vederea efectuării testelor serologice și a preparării antiserului; (b) eliberarea de seruri de referință și de reactivi de referință pentru laboratoarele de referință naționale în vederea standardizării testelor și a reactivilor utilizați în fiecare stat membru; (c) constituirea și conservarea unei colecții de tulpini și de izolați ai virusului
jrc1935as1992 by Guvernul României () [Corola-website/Law/87085_a_87872]
-
a coordona, prin consultare cu Comisia, metodele utilizate în statele membre pentru diagnosticul pestei porcine africane, în special prin: * deținerea și livrarea culturilor celulare pentru diagnostic, * specificarea, deținerea și livrarea sușelor virusului pestei porcine africane în vederea testelor serologice și preparării antiserului, * livrarea serurilor de referință, a serurilor conjugate și a altor reactivi de referință laboratoarelor naționale în vederea standardizării testelor și a reactivilor utilizați în statele membre, * realizarea și conservarea unei colecții a virusului pestei porcine africane, * organizarea periodică a testelor comparative
jrc5631as2002 by Guvernul României () [Corola-website/Law/90801_a_91588]
-
de exemplu Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Datorită parametrilor de citire specificați în această metodă, este un test sensibil (pragul de sensibilitate de 10³ - 104 celule pe ml de extract final de cartof). Factorul critic pentru siguranța rezultatelor testului este calitatea antiserului. Doar antiserul cu un titru superior (minim 2000 pentru antiserul brut) este acceptabil și toate testele trebuie efectuate la titrul antiserului sau o diluție sub titru. Este preferată metoda indirectă. Metoda directă se poate aplica dacă testul are un nivel
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Datorită parametrilor de citire specificați în această metodă, este un test sensibil (pragul de sensibilitate de 10³ - 104 celule pe ml de extract final de cartof). Factorul critic pentru siguranța rezultatelor testului este calitatea antiserului. Doar antiserul cu un titru superior (minim 2000 pentru antiserul brut) este acceptabil și toate testele trebuie efectuate la titrul antiserului sau o diluție sub titru. Este preferată metoda indirectă. Metoda directă se poate aplica dacă testul are un nivel de sensibilitate
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
specificați în această metodă, este un test sensibil (pragul de sensibilitate de 10³ - 104 celule pe ml de extract final de cartof). Factorul critic pentru siguranța rezultatelor testului este calitatea antiserului. Doar antiserul cu un titru superior (minim 2000 pentru antiserul brut) este acceptabil și toate testele trebuie efectuate la titrul antiserului sau o diluție sub titru. Este preferată metoda indirectă. Metoda directă se poate aplica dacă testul are un nivel de sensibilitate și specificitate echivalente metodei indirecte. Testul IF are
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
de 10³ - 104 celule pe ml de extract final de cartof). Factorul critic pentru siguranța rezultatelor testului este calitatea antiserului. Doar antiserul cu un titru superior (minim 2000 pentru antiserul brut) este acceptabil și toate testele trebuie efectuate la titrul antiserului sau o diluție sub titru. Este preferată metoda indirectă. Metoda directă se poate aplica dacă testul are un nivel de sensibilitate și specificitate echivalente metodei indirecte. Testul IF are avantajul interpretării subiective a morfologiei colorației celulare și intensității fluorescenței care
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
de sensibilitate 104- 105 celule pe extract final de cartof). Testul este ieftin și rapid, dar în general mai vulnerabil la false rezultate pozitive (reacții încrucișate) și negative (inhibare de către moleculele fenolice din extractul de cartof). Cerințele de specificitate a antiserului sunt extrem de mari. Testul ELISA nu poate fi folosit ca test de triere unic. 6 Testul PCR PCR are potențialul unei detectări foarte sensibile, deși testul este ușor inhibat de componente de plantă sau de extract de cartof ducând la
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
Producție de levan - Mediile și metodele se găsesc în Lelliott & Stead (1987) Testul IF Se prepară o suspensie de 106 celule pe ml din cultură și din sușa sau sușele de control. Se prepară o serie de diluții duble de antiser. Se aplică procedura IF (secțiunea III.2). Valoarea IF a culturii trebuie să fie echivalentă celei a controlului pozitiv. Testul ELISA Se prepară o suspensie de >106 celule pe ml din cultură și din sușa sau sușele de control. Se
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
extractului se conservă pe perioada testelor la temperatura de 4°C. Se adaugă 10 - 25% (v/v) glicerol steril în cealaltă microfiolă. Se centrifughează. Se depozitează la - 18°C (săptămâni) sau la - 70°C (luni). 2. Testul IF Se folosește antiserul pentru Ralstonia solanacearum, preferabil rasa 3/biovar 2. Se determină titrul unei suspensii de 106 celule pe ml din sușa omologă de Ralstonia solanacearum cu o diluție corespunzătoare de antiser conjugat cu izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Antiserul
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
sau la - 70°C (luni). 2. Testul IF Se folosește antiserul pentru Ralstonia solanacearum, preferabil rasa 3/biovar 2. Se determină titrul unei suspensii de 106 celule pe ml din sușa omologă de Ralstonia solanacearum cu o diluție corespunzătoare de antiser conjugat cu izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Antiserul brut ar trebui să aibă o valoare IF de minim 1:2000. Se utilizează lame microscopice cu mai multe puțuri, de preferință cu 10 ferestre de minim 6 mm diametru
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
antiserul pentru Ralstonia solanacearum, preferabil rasa 3/biovar 2. Se determină titrul unei suspensii de 106 celule pe ml din sușa omologă de Ralstonia solanacearum cu o diluție corespunzătoare de antiser conjugat cu izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Antiserul brut ar trebui să aibă o valoare IF de minim 1:2000. Se utilizează lame microscopice cu mai multe puțuri, de preferință cu 10 ferestre de minim 6 mm diametru. Pe fiecare lamă de test se include un control FITC
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
se usuce. Celulele bacteriene se fixează pe lamă prin încălzire, trecere prin flacără sau cu 95% etanol. 2.3 Procedura IF (i) În conformitate cu pregătirea lamei de test de la 2.1 pct. (i): se prepară un set de diluții duble ale antiserului în tampon IF (apendicele 3): 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T). (ii) În conformitate cu pregătirea lamei de test de la 2.1 pct. (ii): se prepară diluția de
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
apendicele 3): 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T). (ii) În conformitate cu pregătirea lamei de test de la 2.1 pct. (ii): se prepară diluția de lucru (WD) a antiserului în tampon IF. Diluția de lucru este diluția antiserului cu specificitate optimă și este de obicei jumătate din titru. Figura 1 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (i) și 2.3 pct. (i) Diluție standard a extractului concentrat
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
2 din titru (T/2), titru (T) și de două ori titrul (2T). (ii) În conformitate cu pregătirea lamei de test de la 2.1 pct. (ii): se prepară diluția de lucru (WD) a antiserului în tampon IF. Diluția de lucru este diluția antiserului cu specificitate optimă și este de obicei jumătate din titru. Figura 1 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (i) și 2.3 pct. (i) Diluție standard a extractului concentrat resuspendat T = titru FITC T/4 T/2 T
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
este de obicei jumătate din titru. Figura 1 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (i) și 2.3 pct. (i) Diluție standard a extractului concentrat resuspendat T = titru FITC T/4 T/2 T 2T => diluțiile duble ale antiserului Eșantionul 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 Figura 2 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (ii) și 2.3 pct. (ii) FITC Diluție standard a antiserului
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
antiserului Eșantionul 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 Figura 2 Pregătirea lamei de test în conformitate cu 2.1 pct. (ii) și 2.3 pct. (ii) FITC Diluție standard a antiserului pur pur 1/10 !/100 1/1000 => Diluțiile decimale ale extractului concentrat resuspendat Eșantionul 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 2.3.1. Se aranjează lamele pe hârtie
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
extractului concentrat resuspendat Eșantionul 1 ●1 ●2 ●3 ●4 ●5 Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 2.3.1. Se aranjează lamele pe hârtie absorbantă Se acoperă ferestrele de test cu diluția sau diluțiile antiserului. În ferestrele FITC se aplică PBS. Volumul antiserului aplicat în ferestre trebuie să fie echivalent cu volumul extractului aplicat. 2.3.2. Se incubează acoperit timp de 30 de minute la temperatura camerei. 2.3.3. Se scutură picăturile de
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
4 ●5 Duplicatul eșantionului 1 sau al eșantionului 2 ●6 ●7 ●8 ●9 ●10 2.3.1. Se aranjează lamele pe hârtie absorbantă Se acoperă ferestrele de test cu diluția sau diluțiile antiserului. În ferestrele FITC se aplică PBS. Volumul antiserului aplicat în ferestre trebuie să fie echivalent cu volumul extractului aplicat. 2.3.2. Se incubează acoperit timp de 30 de minute la temperatura camerei. 2.3.3. Se scutură picăturile de antiser de pe lamă și se clătesc lamele cu
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
În ferestrele FITC se aplică PBS. Volumul antiserului aplicat în ferestre trebuie să fie echivalent cu volumul extractului aplicat. 2.3.2. Se incubează acoperit timp de 30 de minute la temperatura camerei. 2.3.3. Se scutură picăturile de antiser de pe lamă și se clătesc lamele cu atenție cu un tampon IF. Se spală timp de cinci minute în soluție tampon IF - Tween și apoi cinci minute în tampon IF (apendicele 3). Excesul de umezeală se îndepărtează cu grijă. 2
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
se îndepărtează cu grijă. 2.3.4. Se aranjează lamele pe hârtie absorbantă. Se acoperă ferestrele de test și fereastra FITC cu diluția conjugatului FITC utilizat pentru determinarea titrului. Volumul conjugatului aplicat în ferestre trebuie să fie echivalent cu volumul antiserului aplicat. 2.3.5. Se incubează acoperit timp de 30 de minute la temperatura camerei. 2.3.6. Se scutură picăturile de conjugat de pe lamelă. Se clătesc și se spală ca mai sus (2.3.3). Se îndepărtează cu grijă
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
Notă: Dacă se observă acestea, testul trebuie repetat. Se observă celulele intens fluorescente cu morfologia caracteristică a Ralstonia solanacearum în ferestrele de test. Intensitatea fluorescenței trebuie să fie echivalentă cu cea a sușei de control pozitiv la aceeași diluție a antiserului. Celulele cu colorație incompletă sau cu fluorescență slabă nu trebuie luate în considerare, dacă nu sunt în număr mare (vezi interpretarea rezultatului testului IF). Interpretarea rezultatului testului IF: (i) Dacă nu sunt descoperite celule intens fluorescente cu morfologie caracteristică, atunci
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
este considerat pozitiv, - pentru eșantioane cu N < 10³ celule pe ml de extract concentrat resuspendat testul IF poate fi considerat pozitiv, (iii) dacă se observă un număr mare (>105 celule pe ml) de celule incomplet sau slab fluorescente în titrul antiserului, trebuie efectuat un al doilea test: - un test bazat pe un principiu biologic diferit sau - o repetare a testului IF, cu un al doilea antiser sau cu o diluție de zece ori a extractului concentrat. 3. Testul ELISA În baza
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
un număr mare (>105 celule pe ml) de celule incomplet sau slab fluorescente în titrul antiserului, trebuie efectuat un al doilea test: - un test bazat pe un principiu biologic diferit sau - o repetare a testului IF, cu un al doilea antiser sau cu o diluție de zece ori a extractului concentrat. 3. Testul ELISA În baza Robinson - Smith et al., 1995 Se folosește antiser pentru Ralstonia solanacearum, preferabil rasa 3/biovar 2. Se determină titrul suspensiei de 106 celule pe ml
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
test bazat pe un principiu biologic diferit sau - o repetare a testului IF, cu un al doilea antiser sau cu o diluție de zece ori a extractului concentrat. 3. Testul ELISA În baza Robinson - Smith et al., 1995 Se folosește antiser pentru Ralstonia solanacearum, preferabil rasa 3/biovar 2. Se determină titrul suspensiei de 106 celule pe ml din sușa omologă de Ralstonia solanacearum. Se recomandă folosirea plăcilor de microtritrare NUNC - Polysorb. Se include un extract de cartof de control negativ
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]
-
noapte la 4 șC. 3.4. Se scot extractele din puțuri. Se spală puțurile de trei ori cu PBS - Tween (apendicele 5), lăsând ultima soluție de spălare cel puțin cinci minute în puțuri. 3.5. Se prepară diluția corespunzătoare a antiserului de Ralstonia solanacearum în tampon de blocare (apendicele 5). Se aplică 100 μl de diluție de antiser în puțuri. Se incubează o oră la 37 șC. 3.6. Se scoate antiserul din puțuri. Se spală ca mai înainte (3.4
jrc3681as1998 by Guvernul României () [Corola-website/Law/88841_a_89628]