230 matches
-
cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res. 119, pp. 403-413. (8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1363-1364. ANEXA 4C B.12. MUTAGENITATEA - TESTUL IN VIVO DE MICRONUCLEU PE ERITROCITE DE MAMIFERE 1. METODA Prezenta metodă este reprodusă după linia directoare OCDE TG 474, Testul in vivo de micronucleu pe eritrocite de mamifere (1997). 1.1. INTRODUCERE Testul in vivo de micronucleu pe celule de mamifere se utilizează
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1363-1364. ANEXA 4C B.12. MUTAGENITATEA - TESTUL IN VIVO DE MICRONUCLEU PE ERITROCITE DE MAMIFERE 1. METODA Prezenta metodă este reprodusă după linia directoare OCDE TG 474, Testul in vivo de micronucleu pe eritrocite de mamifere (1997). 1.1. INTRODUCERE Testul in vivo de micronucleu pe celule de mamifere se utilizează pentru detectarea leziunilor cromozomilor sau ale aparatului mitotic al eritroblaștilor produse de substanța de testat; detectarea se realizează prin analiza eritrocitelor
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
12. MUTAGENITATEA - TESTUL IN VIVO DE MICRONUCLEU PE ERITROCITE DE MAMIFERE 1. METODA Prezenta metodă este reprodusă după linia directoare OCDE TG 474, Testul in vivo de micronucleu pe eritrocite de mamifere (1997). 1.1. INTRODUCERE Testul in vivo de micronucleu pe celule de mamifere se utilizează pentru detectarea leziunilor cromozomilor sau ale aparatului mitotic al eritroblaștilor produse de substanța de testat; detectarea se realizează prin analiza eritrocitelor prelevate din măduva osoasă și/sau din celulele sângelui periferic ale animalelor, de
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
utilizează pentru detectarea leziunilor cromozomilor sau ale aparatului mitotic al eritroblaștilor produse de substanța de testat; detectarea se realizează prin analiza eritrocitelor prelevate din măduva osoasă și/sau din celulele sângelui periferic ale animalelor, de obicei, rozătoare. Scopul testului de micronucleu este identificarea substanțelor care produc leziuni citogenetice ce determină formarea de micronuclee conținând fragmente de cromozomi sau cromozomi întregi întârziați. Când un eritroblast din măduva osoasă evoluează într-un eritrocit policromatic, nucleul principal este expulzat; orice micronucleu care se formează
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
de substanța de testat; detectarea se realizează prin analiza eritrocitelor prelevate din măduva osoasă și/sau din celulele sângelui periferic ale animalelor, de obicei, rozătoare. Scopul testului de micronucleu este identificarea substanțelor care produc leziuni citogenetice ce determină formarea de micronuclee conținând fragmente de cromozomi sau cromozomi întregi întârziați. Când un eritroblast din măduva osoasă evoluează într-un eritrocit policromatic, nucleul principal este expulzat; orice micronucleu care se formează poate să rămână în citoplasma anucleată. Micronucleele se vizualizează mai ușor în
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
Scopul testului de micronucleu este identificarea substanțelor care produc leziuni citogenetice ce determină formarea de micronuclee conținând fragmente de cromozomi sau cromozomi întregi întârziați. Când un eritroblast din măduva osoasă evoluează într-un eritrocit policromatic, nucleul principal este expulzat; orice micronucleu care se formează poate să rămână în citoplasma anucleată. Micronucleele se vizualizează mai ușor în aceste celule cărora le lipsește nucleul principal. O creștere a frecvenței eritrocitelor policromatice micronucleate la animalele tratate indică producerea unei leziuni cromozomiale. În prezentul test
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
citogenetice ce determină formarea de micronuclee conținând fragmente de cromozomi sau cromozomi întregi întârziați. Când un eritroblast din măduva osoasă evoluează într-un eritrocit policromatic, nucleul principal este expulzat; orice micronucleu care se formează poate să rămână în citoplasma anucleată. Micronucleele se vizualizează mai ușor în aceste celule cărora le lipsește nucleul principal. O creștere a frecvenței eritrocitelor policromatice micronucleate la animalele tratate indică producerea unei leziuni cromozomiale. În prezentul test se utilizează în mod curent măduva osoasă a rozătoarelor deoarece
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
acceptabilă la toate speciile la care s-a demonstrat incapacitatea splinei de a elimina eritrocitele micronucleate sau care prezintă o sensibilitate specifică pentru detectarea agenților care produc aberații cromozomiale de natură structurală sau numerică. Există numeroase criterii care permit identificarea micronucleelor. Unul dintre acestea este identificarea prezenței sau absenței unui kinetocor sau a ADN centromeric în micronucleu. Frecvența eritrocitelor (policromatice) imature micronucleate este principalul criteriu. De asemenea, numărul de eritrocite (normocromatice) mature în sângele periferic care conține micronuclee printre un număr
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
sau care prezintă o sensibilitate specifică pentru detectarea agenților care produc aberații cromozomiale de natură structurală sau numerică. Există numeroase criterii care permit identificarea micronucleelor. Unul dintre acestea este identificarea prezenței sau absenței unui kinetocor sau a ADN centromeric în micronucleu. Frecvența eritrocitelor (policromatice) imature micronucleate este principalul criteriu. De asemenea, numărul de eritrocite (normocromatice) mature în sângele periferic care conține micronuclee printre un număr dat de eritrocite mature se poate utiliza ca un criteriu în cazul tratării animalelor timp de
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
care permit identificarea micronucleelor. Unul dintre acestea este identificarea prezenței sau absenței unui kinetocor sau a ADN centromeric în micronucleu. Frecvența eritrocitelor (policromatice) imature micronucleate este principalul criteriu. De asemenea, numărul de eritrocite (normocromatice) mature în sângele periferic care conține micronuclee printre un număr dat de eritrocite mature se poate utiliza ca un criteriu în cazul tratării animalelor timp de patru săptămâni sau mai mult. Prezentul test in vivo de micronucleu pe eritrocite de mamifere este relevant în special la evaluarea
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
numărul de eritrocite (normocromatice) mature în sângele periferic care conține micronuclee printre un număr dat de eritrocite mature se poate utiliza ca un criteriu în cazul tratării animalelor timp de patru săptămâni sau mai mult. Prezentul test in vivo de micronucleu pe eritrocite de mamifere este relevant în special la evaluarea riscului mutagen, deoarece permite să se țină seama de factorii de metabolism in vivo, de farmacocinetică și de procesele de regenerare a ADN-ului, deși aceștia pot să varieze între
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
A se vedea și introducerea generală din partea B. 1.2. DEFINIȚII Centromer (kinetocor): porțiune sau porțiuni dintr-un cromozom care în timpul diviziunii celulare este legată cu fibrele fusului mitotic, ceea ce permite deplasarea ordonată a cromozomilor fiice către polii celulelor fiice. Micronuclee: nuclee mici, separate de nucleele principale ale celulelor și prezente în plus față de acestea, produse în timpul telofazei mitozei (meioză) de către fragmentele de cromozomi sau de cromozomii întregi întârziați. Eritrocit normocromatic: eritrocit matur lipsit de ribozomi și care se poate distinge
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
după tratament, se depune pe lamele și se colorează (4) (8) (9) (10). Pentru studiile cu sânge periferic, celulele ar trebui să se recolteze cât se poate de repede după ultima expunere. Lamelele preparate se examinează pentru a depista prezența micronucleelor. 1.4. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE 1.4.1. Preparatele 1.4.1.1. Selectarea speciilor de animale Dacă se utilizează măduvă osoasă, se recomandă șoareci și șobolani, deși se poate utiliza orice specie adecvată de mamifere. Când se utilizează
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
se prevadă martori pozitivi și negativi (solvent/vehicul), utilizați în paralel. Cu excepția tratamentului cu substanța de testat, manipularea animalelor din grupele martor ar trebui să fie identică cu cea a animalelor din grupele tratate. Martorii pozitivi ar trebui să producă micronuclee in vivo la nivelurile de expunere preconizate a genera o creștere detectabilă în raport cu fondul. Dozele de martor pozitiv ar trebui să fie alese astfel încât să se obțină efecte clare, dar fără să releve imediat examinatorului identitatea lamelelor codificate. Pentru martorul
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
cu solvent sau cu vehicul și manipulați în același fel ca grupele tratate, ar trebui să fie incluși la fiecare prelevare de probe, cu excepția cazului în care se dispune de date acceptabile privind variabilitatea inter-animale și frecvența incidenței celulelor cu micronuclee, provenite de la martori anteriori. Dacă, pentru martorii negativi, se face o singură prelevare de probe, momentul cel mai potrivit pentru prelevarea probelor este momentul primei prelevări. În plus, ar trebui să se utilizeze și martori netratați, cu excepția cazului în care
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
pentru ADN. Avantajul menționat nu exclude utilizarea coloranților convenționali (de ex. Giemsa). Se pot utiliza și alte sisteme [de ex. coloane de celuloză pentru eliminarea celulelor nucleate (16)], cu condiția ca sistemele respective să se fi dovedit eficiente pentru prepararea micronucleelor în laborator. 1.5.7. Analiza Pentru fiecare animal se determină proporția de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite (imature + mature) prin examinarea a cel puțin 200 de eritrocite pentru măduva osoasă și 1 000 de eritrocite pentru sângele
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
Fiecare dintre lamele, inclusiv cele cu martori pozitivi și negativi, ar trebui codificată independent, înainte de analiza microscopică. Se identifică minimum 2 000 de eritrocite imature per animal pentru a determina incidența eritrocitelor imature micronucleate. Prin identificarea eritrocitelor mature pentru depistarea micronucleelor se pot obține informații suplimentare. La examinarea lamelelor, proporția de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite ar trebui să fie mai mare de 20% față de valoarea martorilor. Dacă animalele sunt tratate în mod continuu timp de patru săptămâni sau
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
fie mai mare de 20% față de valoarea martorilor. Dacă animalele sunt tratate în mod continuu timp de patru săptămâni sau mai mult, se pot identifica, de asemenea, cel puțin 2 000 de eritrocite mature per animal pentru a constata incidența micronucleelor. Sistemele de analiză automată (analiza imaginii și citometria de flux a suspensiilor de celule) se pot utiliza în locul evaluării manuale, dacă sunt validate și justificate corespunzător. 2. DATELE 2.1. PRELUCRAREA REZULTATELOR Se recomandă prezentarea sub formă de tabel a
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
în mod clar rezultate pozitive sau negative, în cazuri rare datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanței de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile, independent de numărul de experimente. Rezultatele pozitive ale testului de micronucleu indică faptul că substanța induce formarea de micronuclee ca urmare a leziunilor cromozomiale sau leziunilor aparatului mitotic din eritroblaștii speciei testate. Rezultatele negative indică faptul că, în condițiile experimentale, substanța de testat nu produce micronuclee în eritrocitele imature ale speciei
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
cazuri rare datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanței de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile, independent de numărul de experimente. Rezultatele pozitive ale testului de micronucleu indică faptul că substanța induce formarea de micronuclee ca urmare a leziunilor cromozomiale sau leziunilor aparatului mitotic din eritroblaștii speciei testate. Rezultatele negative indică faptul că, în condițiile experimentale, substanța de testat nu produce micronuclee în eritrocitele imature ale speciei testate. Ar trebui să fie discutată probabilitatea ca
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
Rezultatele pozitive ale testului de micronucleu indică faptul că substanța induce formarea de micronuclee ca urmare a leziunilor cromozomiale sau leziunilor aparatului mitotic din eritroblaștii speciei testate. Rezultatele negative indică faptul că, în condițiile experimentale, substanța de testat nu produce micronuclee în eritrocitele imature ale speciei testate. Ar trebui să fie discutată probabilitatea ca substanța de testat sau metaboliții acesteia să ajungă în circulația generală sau în mod specific în țesutul-țintă (de ex. toxicitatea sistemică). 3. RAPORTAREA RAPORTUL TESTULUI Raportul testului
jrc4583as2000 by Guvernul României () [Corola-website/Law/89749_a_90536]
-
in vitro cu un sistem metabolic diferit de cel sau cele utilizate anterior. Dacă testul citogenetic in vitro este pozitiv, trebuie să se efectueze un test in vivo pe celule somatice (analiza metafazelor celulelor măduvei osoase a rozătoarelor sau testul micronucleului la rozătoare). Dacă unul dintre testele de mutație genetică in vitro este pozitiv, trebuie să se efectueze un test in vivo pentru a analiza sinteza neprogramată de ADN sau un "spot test" la șoarece. Linii directoare pentru test Exemplele de
jrc2516as1994 by Guvernul României () [Corola-website/Law/87670_a_88457]
-
un test in vivo pentru a analiza sinteza neprogramată de ADN sau un "spot test" la șoarece. Linii directoare pentru test Exemplele de linii directoare admise pentru teste sunt în special următoarele: - Directiva 92/69/ CEE metoda B12 - Test de micronucleu, - Directiva 87/302/CEE partea B "spot test" la șoarece, - Directiva 92/69/ CEE metoda B11 - Test de citogenicitate in vivo pe măduva osoasă la mamifere - Analiza cromozomială. 5.4.3. Studii in vivo pe celule germinale Situații în care
jrc2516as1994 by Guvernul României () [Corola-website/Law/87670_a_88457]
-
la doză repetată (28 de zile) (administrare cutanată) 144 B.10. Mutageneza (Test citogenetic in vitro pe celule de mamifere) 148 B.11. Mutageneza (Test citogenetic in vitro al măduvei osoase la mamifere, analiză cromozomială) 151 B.12. Mutageneza (Testul micronucleilor celulari) 154 B.13. Mutageneza (Testul de mutație reversă pe Escherichia coli) 157 B.14. Mutageneza (Testul de mutație reversă pe Salmonella typhimurium) 160 PARTEA C: METODE PENTRU DETERMINAREA ECOTOXICITĂȚII 163 C.1. Toxicitatea acută la pești 163 C.2
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/87087_a_87874]
-
coli. Alegerea între cele două organisme experimentale menționate este determinată de natura substanței chimice care se testează. (ii) Teste privind producerea de anomalii cromozomiale în celulele de mamifere, dezvoltate in vitro; se poate accepta și o procedură in vivo (testul micronucleilor și studiul metafazei celulelor de măduvă osoasă). Cu toate acestea, în absența unor contraindicații, metodele in vitro vor fi puternic preferate. D. EVALUARE ȘI INTERPRETARE Există limitări privind măsura în care este posibilă extrapolarea directă la om a rezultatelor obținute
by Guvernul Romaniei () [Corola-other/Law/87087_a_87874]